基于内质网应激探讨钩吻素子调控肠道炎症的作用机制

Intestinal inflammatory disease is a great threat to animal health. Endoplasmic reticulum stress (ERS) can regulate intracellular calcium concentration and reactive oxygen level, which is closely linked to the development of inflammation through the folded protein response. Koumine has anti-inflammatory and immunoregulation activities. Our previous studies showed that koumine alleviated an increase of the level of reactive oxygen, and inhibited the excessive release of inflammatory cytokines though regulation of inflammatory signaling pathway in lipopolysaccharide-induced macrophage, indicating that ERS may be associated with koumine anti-inflammatory effects. A hypothesis which suggests that koumine anti-inflammatory effect depends on ERS regulation was proposed. In LPS-induced inflammation model in vivo and in vitro, this project investigates the effects of koumine on intestinal inflammation, whether ERS participates in koumine anti-inflammatory effects. By using the techniques of gene silencing and cloning to construct a cell model with high expression or low expression of key proteins (e.g. TXNIP and CHOP) in ERS pathway, the influence of ERS on the anti-inflammatory effects of koumine and the relationship between the inflammatory signaling pathway and ERS pathway were further discussed. This project will provide scientific basis for the clinical application of koumine, which is of great significance to promote animal healthy breeding and improve the quality of livestock products.

肠道炎症疾病会给动物健康造成极大威胁。内质网应激能调节细胞内钙离子浓度和活性氧水平，并通过未折叠蛋白反应与炎症的发生发展紧密相连，可作为炎症性疾病新的治疗靶点。钩吻素子具有抗炎和调节免疫等活性。我们前期研究表明，钩吻素子可以缓解脂多糖诱导的巨噬细胞内活性氧水平升高，并可以通过调控炎症信号通路抑制炎症因子的过度释放。本项目提出钩吻素子抗炎作用有赖于内质网应激信号通路调控这一假设，以脂多糖诱导的体内肠道炎症模型和体外猪肠上皮细胞炎症模型，应用分子生物学的方法，研究钩吻素子对肠道炎症的影响，明确内质网应激是否参与钩吻素子抗炎过程，并利用基因沉默和克隆等技术构建内质网应激通路关键蛋白TXNIP和CHOP高低表达的猪肠上皮细胞模型，深入探讨内质网应激对钩吻素子抗炎作用的影响及其与炎症信号通路的相互关系。本项目将为钩吻素子临床应用提供科学依据，对促进动物健康、提高畜产品质量等方面具有重要意义。

动物发生炎症反应时，炎症细胞被激活，大量炎症因子释放，造成组织损伤和器官功能障碍，影响动物生长和健康。内质网应激是细胞的一种保护性应激反应，新近研究表明严重的内质网应激可能通过调控相关信号通路诱发炎症，而中草药可以通过调控内质网应激而抑制炎症信号通路达到抗炎的作用。钩吻素子是钩吻生物碱中含量较高的单体之一，具有抗炎镇痛、调节免疫和抗肿瘤等生物学活性，但其抗炎作用机制鲜见报道。基于我们前期研究并查阅相关文献，我们猜测内质网应激在钩吻素子抗炎机制起着重要作用。因此本课题利用分子生物学、QPCR、ELISA、Westernblot等方法，系统的评价了内质网应激在钩吻素子调控肠道炎症过程中的作用，通过检测炎症因子、细胞内Ca2+、ROS、NO、eNOS、细胞凋亡、ERS信号通路和NF-κB信号通路中关键基因和蛋白水平，探讨钩吻素子对ERS和NF-κB通路的影响；结果表明，钩吻素子能够调控炎症的发生，显示出较好的防控肠道炎症的作用。钩吻素子能够抑制NF-κB、AMPK、PI3K/AKT信号通路，以及抑制氧化应激和ER应激引起的细胞凋亡和自噬，初步探明了内质网应激在钩吻素子抗H2O2诱导的炎症过程中的关系。. 项目组以LPS诱导的猪肠上皮细胞IPEC-J2损伤模型，利用分子生物学、荧光染色等方法通过检测氧化损伤相关指标、肠道屏障、NF-κB和Nrf2信号通路相关蛋白、基因的变化，探讨钩吻素子对肠道屏障保护的作用机制。同时钩吻素子还可以通过调控IPEC-J2细胞中SOD活性，LDH漏出率、MDA水平和ROS的产生，保护H2O2对IPEC-J2细胞的氧化损伤，抑制H2O2引起的IPEC-J2细胞凋亡；koumine在抑制H2O2引起的细胞凋亡过程中，减少了促凋亡蛋白Bax表达，升高了抑凋亡蛋白Bcl-2表达，使得Bax/Bcl-2 的比值在药物作用时随剂量的增加逐渐降低。说明koumine能够保护IPEC-J2细胞对抗H2O2诱导IPEC-J2的氧化损伤，具有一定的时间和剂量依赖关系，其作用机制与抑制细胞凋亡有关。本项目初步探究了钩吻素子抗炎作用机理，为钩吻在兽医临床和其他生物学领域的应用提供可靠的理论依据，为开发以钩吻素子为功效因子的兽药或饲料添加剂提供理论支持。