内、外源性电磁场协同促进组织工程骨血管生成的实验研究

Vascularization is the key point to clinical trials of bone tissue engineering and also is the hot spots of tissue engineering. Unfortunately, at present there is no convincing evidence that any of the existed strategies can sufficiently enhance the vascularization of tissue-engineered constructs. Extremely low frequency pulsed electromagnetic fields not only increased osteogenesis but also promoted angiogenesis when they were used to treat the bone related disease. Furthermore, static electromagnetic fields are able to increase the cell proliferation and up-regulate several angiogenic factors expression of endothelial cells. However, the present basic research and clinical trials only focused on the single effect of either pulsed electromagnetic fields or static magnetic fields. In our opinion, the synergistic effect of these two kinds of electromagnetic field can promote the vascularization in engineered bone tissue quickly and effectively. In this project, bone marrow mesenchymal stem cells and endothelial progenitor cells derived from bone marrow will be seeded into the magnetic hydroxyapatite/poly caprolactone scaffold to construct the vascularized tissue-engineering bone in vitro. Following exposed to the exogenous pulsed electromagnetic fields, cell-scaffold constructs will be implanted into rabbit segmental radius defects to observe the capability of angiogenesis and tissue repair. The aim of this study is to establish a quick, safe and effective strategy for the vascularization of bone tissue engineering and investigate the related mechanism of it. This study has potential significance not only for construct vital engineered bone tissue for the repair of larger defect bone in clinic trials, but also for our understanding the bioeffect of electromagnetic fields.

血管化是组织工程骨临床应用的关键，也是组织工程研究的热点，但是目前尚无理想的方法促进组织工程产品新生血管的形成。极低频脉冲电磁场在治疗骨相关疾病时不仅促进骨质生成，更重要的是促进了患区的新生血管形成。恒磁场亦可以促进血管内皮细胞的增殖和促血管生成因子的表达。但是目前相关基础研究与临床治疗只考虑了单纯的脉冲电磁场或恒磁场的作用，我们认为两种磁场的协同作用可以快速、有效的定向促进骨组织中新生血管形成。本项目拟将骨髓间充质干细胞和其来源的血管内皮祖细胞接种到作为恒磁场的磁性骨组织工程支架上，在外加脉冲电磁场作用下构建含血管结构的组织工程骨，将其植入大段骨缺损区，观察骨缺损修复情况。本研究旨在建立一种快速、安全、有效的组织工程骨血管化的新方法，并探讨组织工程骨构建中新生血管形成的机制，为构建有活力的组织工程骨并应用于临床大段骨缺损的修复奠定理论基础；也为进一步完善电磁场的生物效应提供理论依据。

骨组织工程为骨损伤修复提供了新方向，但是目前骨组织工程存在的一个问题是种子细胞不能在支架上很好的增殖，使得人工骨组织的构建和修复效果并不理想。如何提高支架中种子细胞的增殖和分化，是骨组织工程中急需解决的问题。本课题以骨髓间充质干细胞﹙BMSCs﹚为唯一源细胞，诱导BMSCs 分化为内皮祖细胞（EPCs）。将BMSCs 和EPCs 接种于磁性支架材料nHA/Fe3O4/PLLA上，在外加电磁场作用下检测细胞活性、增殖、分化和矿化能力以及细胞骨架的变化；并用基因芯片、PCR 及蛋白印迹等方法检测血管新生和成骨基因和蛋白的表达改变情况。最后将构建的血管化组织工程骨移植到SD大鼠颅盖骨缺损模型上，观察骨缺损的修复和血管形成情况。结果显示制备的磁性多孔支架nHA-Fe3O4/PLLA具有较高的孔隙率，孔与孔之间连通性良好，为细胞的迁移和长入、营养物质和代谢产物的交换提供良好的条件。经等离子体改性后磁性支架材料对BMSCs和EPCs的增殖有一定的促进作用，而且对BMSCs的分化、矿化和细胞矿化的相关蛋白OPN的mRNA的表达量具有一定的促进作用，支架材料中含10%四氧化三铁的促进作用最显著。在外源性电磁场和磁性支架的协同作用下，种子细胞BMSCs和EPCs在支架上的存活和增殖相比于未加外源电磁场明显提高，而且BMSCs细胞分化和体外矿化能力、EPCs细胞成血管能力也显著地提高。蛋白印迹和mRNA的表达量检测，初步表面外源电磁场和磁性支架的诱导分化的能力是通过提高OPN和1型胶原的表达量，刺激BMSCs矿化和EPCs的成血管能力。Micro-CT结果显示，在外加电磁场的作用下，种子细胞接种于nHA/Fe3O4/PLLA组中骨缺损的边缘已经有明显的新骨形成，而其它各组骨缺损边缘未见新骨形成。本研究旨在建立一种快速、安全、有效的组织工程骨血管化的新方法，为科学解决移植物在修复较大骨缺损时出现的修复时间长、骨改建不完全等难题，提供一种新的理论和技术方法，加快组织工程骨从基础研究向临床应用的步伐；希望为构建体积较大、结构复杂的组织工程产品的血管化探寻一条新途径并奠定理论基础；也为进一步完善电磁场的生物效应提供理论依据。