鼠肝炎模型Th17中关键转录因子RORγt相互作用蛋白的鉴定和功能分析

Th17细胞在乙肝发病中具有极重要促炎作用，而RORγt是Th17细胞分化及行使功能的决定性转录因子，故深入研究RORγt作用机制将有助于阐明其在乙肝发病中的作用机制并提供潜在临床干预靶标。但目前对Th17的研究还局限在与疾病相关性上，对Th17细胞本身分化及其作用的分子机制报道不多，而有关RORγt如何发挥转录作用的机制研究更是空白。鉴于转录因子要与其他反式作用因子协同作用于靶基因启动子区域启动基因转录，故本研究拟用串联亲和纯化、质谱分析、免疫共沉淀和生物信息学分析等方法分离、鉴定Tags-Knock-in小鼠病毒性肝炎模型中与肝炎病毒感染密切相关的RORγt相互作用蛋白质；再激活或阻断这些筛选出的RORγt伙伴蛋白，观察其对肝炎病毒感染的影响。本研究有望从蛋白复合体的角度阐明RORγt作用的分子机制，同时有望获得针对RORγt调节蛋白的干预靶标，为临床乙肝防治提供合理策略。

本研究拟建立并鉴定 RORγt-Tags Knock-in小鼠，从小鼠淋巴细胞中分选Th17细胞；TAP方法纯化该细胞中RORγt蛋白复合体；质谱鉴定筛选所得的相互作用蛋白，Western Blot和 IP验证结果；生物信息学分析所获 RORγt相互作用蛋白，再利用激动剂、抑制剂、过表达或RNAi等方法进一步在细胞和动物水平研究各伙伴蛋白在正常或MHV感染状况下的功能。.按计划，我们已在美国专业转基因小鼠制备公司建立了该转基因小鼠（详细资料可以访问网站 https://client.genetargeting.com）。经鉴定，该小鼠转基因完全正确。我们分别在基因组水平，对插入基因的GFP基因、Neo基因等进行了鉴定，并通过子代交配，产生RORC KI纯合子小鼠。我们进一步在蛋白水平对转基因小鼠进行了鉴定，发现插入金银的RORγt-TAP融合蛋白正确表达、SBP (tag)正确表达。因此，我们最终获得了能正确表达插入基因的转基因小鼠，可以用于后续实验。然后我们利用FACS分选出高纯度KI小鼠CD4+GFP+Th17细胞（纯度>98%）。同时，我们也尝试将FACS分选的Th17细胞体外扩增后再进行质谱分析，以及采用美国NIH陈万军教授实验室的方案，在Th17细胞计划条件下，从naive CD4+T细胞中分化出高比例Th17细胞。最后，本课题组张轶博士在美国NIH赵可吉教授实验室进行约两年的科研研究期间，其和赵可吉教授共同创立一种研究蛋白质相互作用的新方法，即ReMTH-Seq （相关结果已投稿Nature Biotechnology, 在审）。因此，我们进一步尝试用该方法探寻RORc相互作用蛋白。本法基于Protein-fragment complementation assay和二代高通量测序方法，可在较短时间内获得高保真率的RORC相互作用蛋白。目前建立相关文库，正在进行双质粒转染，用FACS分选GFP阳性细胞，然后送测序。初步实验结果显示已经得到足够数量的GFP阳性细胞，正在送华大基因测序，相关结果可在近期产生并撰写高质量学术论文、投稿发表。