成骨和成软骨诱导分化的脂肪干细胞免疫原性研究

传统观点认为脂肪干细胞（ASCs）具有低免疫原性，但我们前期研究发现同种异体ASCs构建的组织工程骨和软骨在动物体内降解速率快，修复组织缺损的能力差且伴有淋巴细胞浸润，因此推测诱导分化后的ASCs不是免疫豁免细胞，异体移植可以诱发免疫反应。本项目将针对成骨/软骨分化的人ASCs免疫原性展开研究，以混合淋巴细胞反应模拟体内免疫微环境条件，通过qPCR、Western blot、ELISA等方法观察ASCs免疫原性相关膜蛋白的mRNA和蛋白表达，以3H-TdR掺入和流式细胞仪检测ASCs的增殖和凋亡；建立Transwell反应体系，阐明不同免疫微环境下免疫原性膜蛋白表达与可溶性细胞因子的相关性，并应用RNA干扰技术验证膜蛋白分子的功能。最后通过细胞标记技术和动物实验，探讨成骨/软骨分化的同种异体ASCs体内免疫反应并观察细胞转归，为异基因ASCs作为组织工程种子细胞的免疫原性研究提供实验依据。

课题组在不使用免疫抑制剂的情况下，将成骨分化的犬同种异体脂肪干细胞（ASCs）复合天然珊瑚支架材料植入到犬颅骨标准缺损区，术后各个观察点未发现CD4/CD8比值及其他免疫细胞因子发生显著改变。术后6月组织学证实有大量新生骨组织形成并保持稳定，局部未发现明显排斥反应。通过绿色荧光蛋白基因标记技术发现植入的细胞存在于再生骨组织中可长达6个月，明确了ASCs在组织工程化骨组织形成过程中的转归。在人脐带血间充质干细胞（UCB-MSCs）体外免疫原性研究方面，以混合淋巴细胞反应模拟体内免疫微环境条件，发现成骨诱导分化细胞HLA-II类分子的阳性表达率升高，对淋巴细胞增殖的抑制作用明显减弱，在干扰素-γ作用后反有刺激淋巴细胞增殖的效果。因此认为成骨分化的UCB-MSCs抑制混合淋巴细胞增殖反应的效果明显低于未诱导UCB-MSCs，不适合作为骨组织工程及细胞治疗的同种异体细胞来源。.课题组观察了自体ASCs移植对卵巢切除术后骨质疏松兔的影响，发现自体干细胞移植治疗12周后，细胞治疗组股骨远端骨密度、数量、厚度及结构模型指数均明显改善。组织学检测发现实验组骨小梁厚度增宽，植入的藻酸钙材料已降解，而对照组骨小梁较纤细，材料有残留。证实自体ASCs移植对兔骨质疏松有一定的治疗效果。.关于组织工程骨成骨条件，我们对骨髓基质干细胞（BMSCs）的干细胞比例、成骨特异性指标等进行了研究，发现与新鲜分离的骨髓单个核细胞（BMNCs）和未分化的BMSCs相比，成骨诱导分化的第2代BMSCs具有较好的体内外成骨能力。.牛血清白蛋白（BSA）是胎牛血清中含量最高的蛋白质成分，而且多孔生物支架材料易于吸附BSA。作为异种来源蛋白，BSA残余量过高会导致免疫排斥反应，影响组织工程骨植入人体的安全性。本研究表明：酶联免疫法适用于组织工程骨中BSA 残余量的检测。现有条件下构建的组织工程骨BSA残余量仍然较高，组织工程骨植入前的清洗对BSA残余量有显著影响。.本课题立项研究以来，已发表受课题资助的SCI 论文8篇，以及中文核心期刊论著5篇。参加国内学术会议交流3次。独立指导硕士研究生2人（邹文焘，朱麟），联合培养硕士生3人（许益聘、林和敏、廖彩荷）及博士后2人（单连成、张坤玺）。