桃儿七体细胞胚胎发生及其机理研究

Sinopodophyllum emodi (Wall.) Ying is rare and endangered Chinese medicinal herbs. Somatic embryogenesis is the main way of seedling rapid propagation and germplasm enhancement. The prior studies showed that the rate of embryonic callus was low and the development of somatic embryos was in different stages and the abnormal embryo was serious. Which restrict the regeneration plants through the process of somatic embryogenesis. So it is necessary to further research the development of somatic embryos and the occurrence mechanism. Based on the experimental system of somatic embryogenisis in Sinopodophyllum emodi (Wall.) Ying. The studies on somatic embryo induction and synchronized regulation were done to obtain the somatic embryos at different developmental stages. Histological observation on the origin and development of somatic embryos. Study on physiological and biochemical metabolic rule of the hormones and enzymes and polyamines of somatic embryogenesis in different development stages. Genome sequence related to the key period of somatic embryogenesis of Sinopodophyllum emodi (Wall.) Ying will be done with solexa sequencing method, and screening the differential expression genes of somatic embryogenesis. To reveal the mechanism of somatic embryogenesis at the level of cytological and physiological and biochemical and transcriptome to lay a theoretical foundation for biotechnology breeding and germplasm conservation and fast propagation of Sinopodophyllum emodi (Wall.) Ying.

桃儿七Sinopodophyllum emodi (Wall.) Ying是我国珍稀濒危中药材，体细胞胚胎发生是其种质资源创新和种苗繁殖的主要途径，前期研究发现其胚性愈伤组织诱导率低、体细胞胚发育不同步且体细胞胚畸形化严重，制约了体细胞胚胎发生技术在桃儿七无性繁殖方面的应用，因此有必要对其体细胞胚发生机理进行深入研究。本研究拟在已建立的桃儿七体细胞胚培养体系上，开展体细胞胚诱导和同步化调控研究，获取不同发育阶段的体细胞胚材料，通过组织细胞学观察，研究体细胞胚胎的起源及其形态建成过程；采用生理生化技术测定体细胞胚发生过程中生物活性酶、内源激素及多胺的代谢规律；利用Solexa高通量测序技术对体细胞胚发生的关键时期进行测序和差异基因表达谱分析，筛选与体细胞胚发生相关的基因；从组织细胞学、生理生化特性和转录组水平探讨其体细胞胚发生机理，为桃儿七的生物技术育种、种质资源保存和种苗快繁奠定理论基础。

体细胞胚发生对濒危中药材桃儿七种苗繁育、种质创新和种质资源保护具有重要意义，对其体细胞胚发生的调控因子及体胚发育机理的研究非常必要。本项目主要获得以下研究结果：1. 建立了以桃儿七合子胚和无菌苗下胚轴为外植体的体细胞胚诱导培养体系，为桃儿七种质创新和保护奠定了基础；2.确定了桃儿七体细胞胚发生存在外起源和内起源两种方式，外起源方式的球形胚发生在胚性愈伤组织的外表层细胞；内起源方式的球形胚起源于胚性愈伤的内层细胞，且体细胞胚发生存在不同步性，是导致体细胞胚畸形的原因之一；3. 确定了桃儿七体细胞胚不同发育时期3种生理活性酶（SOD、POD、CAT）的代谢规律：可作为鉴定桃儿七体细胞胚发生过程中特定时期的参考标记；4.揭示了桃儿七体细胞胚胎发生过程中各类内源激素的积累规律及相关作用：细胞分裂素在胚性细胞启动阶段积累量较低，对体细胞胚的发生和维持起到了重要的作用；赤霉素参与了桃儿七体细胞胚的形成，但对体细胞胚的成熟具有抑制作用，桃儿七体细胞胚发育中期由于内源脱落酸积累不足，体胚萌发过早，导致后期畸形胚发生率较高。这也与后期桃儿七体胚再生苗发育不良相印证；5. 通过对4个不同发育阶段的桃儿七体细胞胚材料进行转录组测序、数据分析以及差异表达基因鉴定、验证，发现不同发育阶段的转录组的差异基因KEGG富集分析显示IAA、玉米素、GA和ABA的生物合成在体细胞胚发育中发挥重要作用，其中玉米素降解相关基因CKX在ICpEC时期表达量较高，推测较低含量的玉米素对EC进一步分化和ICpEC形成具有促进作用，验证了与植物内源激素代谢、传导相关的6个基因，与鬼臼毒素合成相关的9个基因，表达量与转录组测序获得的表达量趋势一致。综上，从体细胞胚的起源、内源激素代谢规律、及生物活性酶的代谢规律和转录组水平阐述了桃儿七体细胞胚发生的机理，为进一步探究激素信号调控桃儿七体细胞胚发生的分子机理奠定了基础。