樟子松无性系（GS1）体细胞胚胎发生机理研究

At present the situation of desertification control in our country is still grim, and superior clone of Pinus sylvestris var. mongolica named GS1 as one of the improved varieties of forest tree in arid region would have broad application prospects, but technical limitations of breeding have led to a serious shortage of seedling reserves. This project aims to develop technology of somatic embryogenesis by carrying out comprehensive experiments in aspects of induction, proliferation, differentiation, rooting and germination in embryogenic callus, in order to achieve high frequency of induction, synchronized differentiation, and high frequency of rooting. At the same time, iTRAQ technology would adopted to identify embryogenic callus and explore mechanism of desiccation. This research would fill the blank of somatic embryogenesis mechanism of GS1, and initially establish plant regeneration system to provide necessary theoretical and technical support for large-scale application of GS1 in arid region.

目前我国防沙治沙形势依然严峻，樟子松优良无性系（GS1）作为三北干旱地区林木良种具有广阔的应用前景，然而由于繁殖技术局限，其苗木储备严重不足。本项目拟对GS1开展体细胞胚胎发生技术研究，在胚性愈伤组织诱导、增殖、分化及生根萌发等方面进行系统试验，以实现诱导高频化、分化同步化、生根高频化。同时，基于iTRAQ技术开展胚性愈伤组织鉴别及体细胞胚干化萌发机理研究。通过项目研究填补GS1体胚发生机理空白，初步建立起GS1植株再生体系，为GS1在三北地区规模化应用提供必要的理论和技术支撑。

经数十年引种造林，樟子松(Pinus sylvestris var. mongolica)已在我国“三北”地区形成较大面积人工林，并表现出抗旱、耐寒、耐瘠薄土壤等优良特性。为更好发展樟子松，不断提高其遗传品质和良种产量，项目合作单位——辽宁省固沙造林研究所(2019年更名为辽宁省沙地治理与利用研究所)于上世纪70年代中期～80年代初期完成了365个无性系、66.7hm2的初级种子园建设，并建立半同胞子代测定林5hm2。通过母树生长量、结实量实测，以及种子园半同胞子代17年来的生长表现，选取最佳无性系，命名为固沙1（GS1）。2007年GS1通过了省级林木品种审定，2017年又被国家林业局纳入到三北地区林木良种名录。然而由于种子园内只有9株GS1母树，且已过产种盛期，每年能采收的种子很少，个别年份还存在绝收现象，因此直接利用种子繁殖所产GS1远远不能满足造林应用的需要。为扩大樟子松优良无性系(GS1)在沙地上的引种栽培，本项目以合子胚为外植体开展了GS1体细胞胚胎发生技术和机理研究，历经4年时间，取得了多方面的进展。项目组通过多次取样、显微观察及实验，细化了GS1未成熟胚发育阶段、优化了培养基种类、明确了各类激素的功能，使愈伤组织诱导率由0%提升至60%左右；通过对比固定增殖、半固定增殖及液体悬浮增殖等方式筛选出半固定增殖为最佳方式，进一步通过环境因子与激素配比的优化使增殖率明显提高，并较大比例维持胚性；通过蛋白质组学分析揭示了胚状体干化变色及保持较高最大光化学效率的分子机制，在干化过程中差异表达蛋白质数量达2140个，亚细胞定位于胞质溶胶、胞间连丝、叶绿体基质和叶绿体膜，主要参与碳代谢和次生代谢；在筛选出最佳干化方式基础上，构建了离体胚萌发生根体系；开展了以成熟胚、下胚轴、侧芽、针叶等外植体的愈伤组织诱导实验，筛选出了适宜成熟胚和侧芽愈伤诱导的基质配方，在暗培养条件下成熟胚愈伤组织诱导率可达80%，侧芽外植体也取得了进展，这为打破未成熟合子胚取材时期不好掌握的限制提供了后续的研究方向。