深海嗜酸硫化芽孢杆菌TPY遗传操作系统的建立及其硫代谢途径相关基因的功能研究

Sulfobacillus acidophilus TPY is a gram-positive, moderately thermophilic and acidophilic bacterium isolated from hydrothermal vent in the Pacific Ocean (12.2`29``N, 104.2`01``W, water depth 3083 m). Compare with mesophilic microorganisms and extreme thermophilic microorganisms, S. acidophilus TPY can grow in higher temperature and have higher pulp density tolerance, thus may offer some advantages in industrial applications of bioleaching. The gene expression and knock out systems have not been constructed for these microorganisms and the sulfur metabolic pathway of S. acidophilus TPY has not been established. For these two reasons, this project focuses on the following aspects: (1) Study the transcriptomes of S. acidophilus TPY cultured on elemental sulfur or SO42- to reveal its sulfur metabolism pathway; (2) Over-express the sulfur oxygenase reductase gene sor in S. acidophilus TPY to find out its function in the sulfur oxidation pathway; (3) Knock out the β subunit gene cysI of sulfite reductase to depress the sulfur reduction pathway and figure out its true function in the pathway.These results will provide some fundation for the elucidation of sulfur metabolic pathway in S. acidophilus TPY and the genetic manipulation of this strain.

深海嗜酸硫化芽孢杆菌TPY分离自太平洋深海热液口，是一株中等嗜热G+浸矿菌，它具有较高的最适生长温度（相比中温菌），并且可以耐受较高的金属离子浓度（相比古菌），具有极好的应用前景。目前对于嗜酸硫化芽孢杆菌的遗传操作系统尚未建立，对其硫氧化还原代谢途径还不是很清楚。为此，本项目在完成全基因组测序的基础上拟开展以下研究：（1）研究嗜酸硫化芽孢杆菌TPY在单质硫和硫酸根培养条件下的转录组，揭示其硫氧化还原代谢途径；（2）在嗜酸硫化芽孢杆菌TPY中过表达硫氧化还原酶基因sor，研究其在硫氧化途径中的功能；（3）在嗜酸硫化芽孢杆菌TPY中敲除亚硫酸盐还原酶β亚基基因cysI，研究该酶在硫还原途径中的功能。这些研究结果将为阐明嗜酸硫化芽孢杆菌TPY的硫代谢途径奠定基础，为其遗传改造提供依据。

深海嗜酸硫化芽孢杆菌TPY分离自太平洋深海热液口，是一株中等嗜热G+浸矿菌，它具有较高的最适生长温度（相比中温菌），并且可以耐受较高的金属离子浓度（相比古菌），具有极好的应用前景。目前对于嗜酸硫化芽孢杆菌的遗传操作系统尚未建立，对其硫氧化还原代谢途径还不是很清楚。为此，本项目开展以下三方面研究并取得重要进展。（1）为了弄清嗜酸硫化芽孢杆菌TPY代谢硫及无机硫复合物（RISC）的代谢途径，本项目开展了嗜酸硫化芽孢杆菌TPY在单质硫和SO42-培养条件下的转录组研究，分析参与硫氧化还原代谢途径的基因，推测嗜酸硫化芽孢杆菌TPY硫代谢途径，是一种兼有硫氧化和硫还原组成闭合代谢回路的硫代谢途径。（2）本项目克服了兼性中等嗜热自养菌嗜酸硫化芽孢杆菌TPY和异养菌大肠杆菌在培养条件上的巨大差异，成功实现了二者的共培养。以此为基础，利用接合转移的方法成功地将表达载体pTrc99a-sor-oriT转化至嗜酸硫化芽孢杆菌TPY中进行硫氧化还原酶基因sor的过表达。利用Western-Blot验证了蛋白的表达，并通过生理生化实验验证了过表达SOR的功能，通过RT-PCR验证了推测的嗜酸硫化芽孢杆菌TPY硫代谢途径。（3）本项目构建了嗜酸硫化芽孢杆菌TPY cysI基因打靶载体pksv7-a-tet-b-orit，将打靶载体pksv7-a-tet-b-orit转化至供体菌E. coli S17-1中，采用大肠杆菌-嗜酸硫化芽孢杆菌接合转移系统，试图将打靶载体pksv7-a-tet-b-orit转移到嗜酸硫化芽孢杆菌TPY中，并筛选cysI基因敲除突变体，未能成功。由于在嗜酸硫化芽孢杆菌TPY cysI基因（编码亚硫酸盐还原酶β亚基即血红素蛋白亚基）所在的操纵子未能找到α亚基的编码基因，但是在嗜酸硫化芽孢杆菌TPY苯酚降解操纵子中苯酚羟化酶的还原酶亚基（mhpP, TPY_0634）具有和已报道的亚硫酸盐还原酶α亚基即黄素蛋白亚基一定的序列相似性。因此，本项目在大肠杆菌中对该酶进行体外表达、纯化和功能验证。分析表明MhpP具有植物型Ferredoxin结构域，据报道Ferredoxin被还原的电子能被传递给亚硫酸还原酶。这些研究结果阐明了嗜酸硫化芽孢杆菌TPY的硫代谢途径，并且提供了一种遗传操作方法，为其遗传改造提供依据。