p53调节BMP-Smad信号通路及其在肺动脉高压中的作用

Pulmonary arterial hypertension(PAH) is characterized by elevated pulmonary arterial pressure. Vascular remodeling is the common response in various classes of PAH and proliferation of pulmonary arterial smooth muscle cells(PASMCs) contributes to vascular remodeling mostly. Bone morphogenetic protein (BMP) signaling plays a critical role in PAH, however, the specific and effective mechanism remains to be explored. The present proposal will utilize cultured adult rat PASMCs, molecular biological technologies and methods, including western blot, RNAi, Wst1 proliferation assay and zoopery etc, to clarify a novel regulation mechanism of BMP-Smad signaling pathway and a unique epistatic relationship between ATM and p53 in PAH, which is mediated by the BMP-Smad pathway. Firstly, demonstrate the negative feedback regulation of serum starvation to Smad1, Secondly, discover the role of p53 in regulating Smad1 during the development of vascular remodeling and the possible mechanism that p53 negatively regulate Smad1 expression through p21-E2F1 pathway. Thirdly, probe the role of ATM in regulating Smad1 and the principle that p21-E2F1-mediated Smad1 elevation. Lastly, we take the experiment on animal to investigate the phenomenon of the relationship between ATM-p53 and BMP-Smad pathway. In summary, the present project may provide a link between the anti-proliferation ATM-p53-21 pathway and the developmentally indispensable BMP-Smad pathway. It also offers new promising molecular targets and yield a novel therapeutic strategy for the prevention and treatment of PAH .

肺动脉高压（PAH）是以肺动脉压力增高为特征的一类疾病，其发病机制至今仍不明了。目前已明确血管重构是PAH发病的重要病理特征，因而延缓肺血管重构，改善心肺功能是药物治疗PAH，提高患者生存率的关键靶点。已证实骨形态发生蛋白（BMP）信号通路与PAH的发病密切相关，但其具体的作用机制仍需探索。本研究运用western blot、RNAi等技术，试图阐明：1）血清饥饿或BMP抑制对Smad1的负反馈调节作用；2）p53通过p21-E2F1通路调节Smad1表达；3）毛细血管扩张性共济失调突变基因（ATM）通过调节p53表达改变Smad1的活化；4）通过动物实验全面验证上述理论。综上，本项目可建立ATM-p53和BMP-Smad两个通路之间的关系，证明ATM-p53通过BMP-Smad1调节PAH的形成。这对于寻找治疗PAH提供新的分子理论指导，对于促进人民健康、提高生活质量具有重要意义。

肺动脉高压（PAH）是以肺动脉压力增高为特征的一类疾病，其发病机制至今仍不明了。目前已明确血管重构是PAH发病的重要病理特征，因而延缓肺血管重构，改善心肺功能是药物治疗PAH，提高患者生存率的关键靶点。已证实骨形态发生蛋白（BMP）信号通路与PAH的发病密切相关。但其具体的作用机制仍需探索。本研究利用离体培养的大鼠原代肺动脉平滑肌细胞以及低氧诱导的PAH模型，运用RNAi干扰以及荧光素酶报告基因分析等多种实验技术进行研究。结果发现：原代培养的大鼠PASMC细胞及多种细胞系（人脐静脉内皮细胞和293A细胞）验证，血清饥饿后Smad1蛋白表达会上调，同时BMP抑制剂Noggin可抑制 Smad1的表达，提示血清中存在的BMPs可能调节Smad1表达。降低体外培养PASMC细胞培养基中的血清浓度，加入BMP抑制剂Noggin或转染Smad1的蛋白磷酸酶PPM1A都会导致Smad1蛋白水平的上调。免疫荧光等技术发现Smad1主要定位在核周区域，血清饥饿时Smad1在细胞质的表达增加。同时转染Smad1的E3泛素连接酶Smurf1，正常情况下Smurf1会使Smad1发生降解，但是血清饥饿后对Smad1的表达没有明显作用。加入蛋白合成抑制剂CHX，发现抑制BMP2会使Smad1蛋白稳定性增加，并导致Smad1蛋白水平上升，但是抑制BMP2作用对PASMC细胞的增殖却没有影响。最后在PASMC细胞中过表达Smad1或者Smad1 SXS对细胞的增殖也没有显著性影响。提示去除或抑制BMP会导致Smad1的稳定和重新定位，并影响Smad1活化速度和幅度。荧光素酶报告基因分析发现p53直接结合Smad1启动子1000bp以内从而直接调控Smad1表达而不经过p21-E2F1途径。ATM作为p53上游，ATM消减后PASMC细胞中Smad1蛋白表达明显降低，p53和p21蛋白的表达明显增加，同时ROS的表达也增加。结果与p53过表达一致，提示ATM通过ROS负性调控p53直接参与BMP-Smad信号通路。最后我们利用低氧性大鼠PAH在体实验证实，ATM负性调控p53影响低氧性PAH大鼠肺动脉压以及肺血管细胞的凋亡，血管肌化以及纤维化等。这些研究结果提示，ATM可以负性调控p53表达，从而直接与Smad1启动子结合调控BMP-Smad信号通路参与低氧性肺动脉高压的进展。