单催化域双功能木聚糖酶的分子催化机理研究

双功能酶能有效降解饲料中的多种抗营养因子,具有广阔的应用前景。首次克隆到仅有一个催化结构域双功能木聚糖酶XynBE18，同时具有木聚糖酶和葡聚糖酶两种活性。与目前发现的多功能酶由不同的催化结构域/活性中心催化不同，其同一活性中心可同时结合并催化两种底物。本项目利用SCHEMA结构分析工具, 以木聚糖酶XynBE18和与其具有高氨基酸序列一致性(61.7%)的单结构域单功能木聚糖酶XynE2为材料进行分子重组，构建多个能正常折叠的杂合重组蛋白，对其酶学性质进行测定，确定酶和底物结合、催化的功能结构域，结合计算机模拟，构建合理的底物结合模型，初步确定与底物结合及催化相关的关键氨基酸残基。进一步利用定点突变等手段，验证相关氨基酸残基在酶与不同底物结合及催化时所起的作用，阐明单催化域双功能木聚糖酶与不同底物结合及催化的分子机理，从而更好地理解木聚糖酶结构与功能的分子机制,并指导酶的分子改良。

木聚糖的结构非常复杂，其主链是D-吡喃木糖通过β-1,4糖苷键连接形成，侧链上还连接有阿拉伯糖、葡萄糖醛酸、阿魏酸酯基、乙酰基等不同的取代基，因此，木聚糖的完全降解需要多个酶的共同作用才能完成。本研究以已报道的来源于Paenibacillus sp. E18的一个同时具有木聚糖酶和葡聚糖酶活性的单结构域双功能木聚糖酶XynBE18为材料，针对其独特的催化机制及其与两个阿拉伯呋喃糖苷酶的协同作用进行初步研究，从而为木聚糖的充分降解和有效利用提供科学依据。本项目的主要内容包括：1）木聚糖相关酶基因簇中XynBE18与43家族的两个α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的协同作用，结果表明Abf43A和Abf43B单独作用于燕麦、桦木和榉木木聚糖时没有寡糖的生成，当二者与XynBE18同时反应或以“先阿拉伯呋喃糖苷酶，后木聚糖酶”的连续反应时观察到显著的协同效果。当底物为小麦阿拉伯木聚糖时，Abf43A单独作用时能生成阿拉伯糖，与XynBE18同时作用或连续作用所生成的还原糖量都比二者单独作用时有明显增加，而Abf43B在该底物的协同反应中没有作出贡献。主要结果已在Applied and Environmental Microbiology杂志上发表（Appl Environ Microbiol. 2013, 79(6):1990-5. IF=3.95）。2）利用SCHEMA软件计算分析，分别将XynE2和XynBE18分为4段和3段，对野生型及突变体的底物特异性比较分析表明与XynBE18底物特异性有重要相关的氨基酸位点位于其N–端和C–端，尤其是C–端的174个氨基酸中，这将有利于后期实验中关键氨基酸的确定。3）通过生物信息学分析确定了相关关键氨基酸位点，进行了丙氨酸扫描突变。对野生型及突变体的底物特异性比较分析表明证实了双功能木聚糖酶XynBE18对两种底物共用两个催化位点（E129, E236）。C端关键的底物结合位点（W286, W294, F298）对两种底物起到关键的结合作用。A59R，W306, W321位点对葡聚糖的结合的影响大于木聚糖的结合。本课题初步探索了单结构域双功能木聚糖酶的底物催化机理，确定了与葡聚糖底物结合有关的关键区域，关键氨基酸位点的确定和今后木聚糖酶的分子改造提供了理论基础。