多结构域双功能纤维素酶/木聚糖酶CbXyn10C/Cel48B底物特异性的分子机制研究

Cellulose and xylan are two major non-starch polysaccharides. Using bifunctional enzymes to simultaneously deconstruct the two polysaccharides can reduce the cost of feed enzymes. However, there are few researches in the molecular mechanism underlying the substrate specificity of such kind of enzymes, which limits their molecular improvement. CbXyn10C/Cel48B is a unique multimodular bifunctional cellulase/xlyalanse, with its N- and C-termini being a xylanase and cellulase, respectively. Two cellulose-binding modules, i.e. CBM3bs, separate the two catalytic domains apart. CbXyn10C is the first GH10 xylanase which can efficiently hydrolyze crystalline cellulose. In addition, CbCel48B can degrade xylan. Since CBM affects the substrate specificity of enzymes in various aspects including the topology of the enzyme active center and the interaction between enzyme and substrates, it is postulated that the substrate specificity of CbXyn10C/Cel48B is not only determined by the two catalytic domains in the N- and C-termini, but also affected by the CBM3bs. By using molecular docking and dynamic simulation, the enzyme-substrate structures will be determined. A series of mutant enzymes will be constructed, while a novel immunofluorescence technique will be introduced. The synergy between the two catalytic domains and the biochemical characteristics of the wild-type and mutants of CbXyn10C/Cel48B on model substrates as well as intact plant cell walls will be determined. Based on the results from these experiments, the molecular mechanism underling the substrate specificity of CbXyn10C/Cel48B will be uncovered.

纤维素和木聚糖是两种主要的非淀粉多糖，使用双功能酶同时降解这两种多糖有利于降低饲用酶的成本，但对此类酶底物特异性分子机制研究不多，限制了分子改良。CbXyn10C/Cel48B是一个独特的多结构域双功能纤维素酶/木聚糖酶，其N端和C端分别为木聚糖酶和纤维素酶，间以结合纤维素的双CBM3bs。CbXyn10C是10家族酶中第一个能高效降解微晶纤维素的；而CbCel48B却又能降解木聚糖。由于CBM在催化中心的拓扑结构、酶和底物的相互作用等方面也影响着酶的底物特异性，推测CbXyn10C/Cel48B的底物特异性不仅受两端催化结构域决定，还受CBM3bs影响。将通过分子对接和动力学模拟分析酶-底物复合物结构，系统引入突变和新型免疫荧光技术，测定酶的两个催化结构域间的协同作用、野生型和突变体在模式底物和完整植物细胞壁上的作用方式，据此推定决定CbXyn10C/Cel48B底物特异性的分子机制。

项目背景：.嗜热细菌Caldicellulosiruptor bescii具有强大的木质纤维素降解能力，已发现其基因组编码一个木质纤维素利用基因簇，其中许多酶是多结构域双功能酶，但它们的作用机制并不清楚。..研究内容：.项目以嗜热细菌C. bescii来源的多结构域双功能纤维素酶/木聚糖酶CbXyn10C/Cel48B为核心材料，系统阐明决定其底物特异性的分子机制，研究从（1）N端催化结构域CbXyn10C底物特异性的分子机制、（2）C端催化结构域CbCel48B底物特异性的分子机制和（3）催化结构域和底物结合结构域CBM3bs分别对CbXyn10C/Cel48B底物特异性的影响等三个方面全面详细研究了该蛋白底物特异性的决定机制。..重要结果：.研究发现双功能木聚糖酶/纤维素酶CbXyn10C至少含有6糖的结合位点；通过结晶及分子对接方法获得了CbXyn10C与木寡糖或纤维寡糖的复合物结构，通过突变分析彻底阐明了底物结合口袋中非催化性残基对于底物特异性的贡献，在此基础上构建获得了分别对木聚糖和纤维素催化效率提高的突变体，揭示了底物杂泛性在第10家族木聚糖酶中的普遍性存在。截短突变证明底物结合结构域对于酶的催化效率有显著影响；酶的N端和C端催化结构域之间在降解纤维素时存在协同作用，而降解木聚糖的增效则严格依赖于分子内的协同作用。此外，还建立了间接免疫荧光分析和电镜分析技术。项目执行期间，共发表论文16篇，其中在SCI收录的杂志发表研究论文12篇，其中第一标注3篇，第二标注7篇。..关键数据：.项目获得了双功能木聚糖酶/纤维素酶及其与两种不同构型底物的三维晶体结构、酶与底物的结合常数、催化常数、各种定点突变和截短突变体以及突变体的生物化学、生物物理和免疫学分析数据，这些数据综合起来为阐明该酶的底物杂泛性和催化效率的分子机制起到关键作用。..科学意义：.研究通过阐明多结构域双功能酶催化结构域和底物结合结构域对于底物结合和催化效率的贡献的分子机制，为开发高效降解饲料的木质纤维素解酶提供了理论指导。