SIRT1和SIRT2在多巴胺能神经元死亡中的作用和活性调节

帕金森病是第二高发的神经退行性疾病，其病理特征是中脑黑质多巴胺能神经元的变性、死亡，但是多巴胺能神经元死亡的分子机制不明，目前临床主要是对症治疗，尚缺乏疗效高、副作用少的治疗手段。研究发现，SIRT1 和SIRT2和老化关系密切，升高SIRT1的活性或抑制SIRT2的活性，对帕金森病模型多巴胺能神经元具有一定的保护作用。但是在帕金森病中二者活性的变化及调节，目前尚无研究。本课题采用小鼠MPTP帕金森病模型，研究参与帕金森病多巴胺能神经元死亡的磷酸激酶CDK5和GSK3 beta 对SIRT1和SIRT2活性的调节作用。阐明SIRT1/SIRT2的活性调节机制，及其活性改变对多巴胺能神经元存活的意义。本研究不仅可能揭示帕金森病人多巴胺能神经元死亡的分子机制，并且这一机制可能为研究多种神经退行性疾病神经元死亡的机制提供线索。

帕金森病是第二高发的神经退行性疾病，其病理特征是中脑黑质多巴胺能神经元的变性、死亡，但是多巴胺能神经元死亡的分子机制不明，目前临床主要是对症治疗，尚缺乏有效的对多巴胺能神经元有保护作用的药物。文献报道，升高SIRT1的活性或抑制SIRT2的活性，对帕金森病模型多巴胺能神经元具有一定的保护作用。但是在帕金森病中二者活性的变化及调节，其活性改变对神经元的作用，是通过何靶分子实现的，目前尚无报道。本课题研究SIRT2的活性是怎样被调控的。.首先我们通过体外激酶实验证明了磷酸激酶GSK3beta和CDK5均可以磷酸化SIRT2，GSK3beta可能磷酸化Sirt2上的三个磷酸化位点。免疫共沉淀实验证明GSK3beta 和SIRT2在细胞内可以直接结合。我们在 H4细胞中MPP+处理后，检测SIRT2含量和活性，发现细胞内SIRT2含量有一过性增加，其底物乙酰化H4下降。为了检测SIRT2在细胞内是否被GSK3beta磷酸化，我们制备了该三个磷酸化位点特异性的SIRT2抗体，检测细胞在神经毒素刺激下SIRT2磷酸化的改变。在培养的SH-SY5Y细胞中，6-羟多巴胺可以使胞浆中乙酰化tubulin降低，而胞核中乙酰化H3升高；GSK3beta活性升高，SIRT2的磷酸化升高；应用GSK3beta抑制剂，可以显著抑制SIRT2磷酸化的升高。为了研究SIRT2对神经元存活的影响，我们在大脑皮层神经元中过表达SIRT2，结果表明SIRT2可以诱导神经元死亡，而过表达模拟磷酸化的SIRT2突变体，可以进一步促进神经元死亡，提示可能是SIRT2的过表达和磷酸化促进神经元的死亡。而在6-OH dopamine 诱导的神经元死亡中，细胞中转染SIRT2 shRNA可以使神经元死亡显著降低，进一步证明SIRT2促进6-OH dopamine 诱导的神经元死亡。为了检测在帕金森病模型中，SIRT2的磷酸化是否有改变，我们在MPTP诱导的的帕金森病小鼠模型中，检测了中脑黑质SIRT2磷酸化，发现在MPTP模型中SIRT2磷酸化增高。使用SIRT2抑制剂，可以减少MPTP导致的多巴胺能神经元死亡。.本课题采用小鼠MPTP帕金森病模型，研究参与帕金森病多巴胺能神经元死亡的磷酸激酶CDK5和GSK3 beta 对SIRT1和SIRT2活性的调节机制，及其活性改变对多巴胺能神经元存活的意义。