H19介导miR-let7在妊娠期糖尿病中作用及分子机制研究

The H19 gene encodes a 2.3 kb non-coding RNA which is maternally expressed while paternally imprinted , and conserved on mammalian evalution. This gene is one of the first imprinted genes to be identified, but its effect and mechanism remains unknown during the decades.They are enriched in placenta and embryo tissues. They are thought to be engaged in the regulation of cell proliferation,development and metabolism maintenance.To investigate the effect of imprinting gene H19 in the GDM in order to explore the regulatory mechanism of H19 in the gene regulation in the glocose metabolism.After correct identification with sequencing for the recombinant eukaryotic expression plasmid psiCHECK-H19 including the whole length of H19 cDNA, the plasmid was transfected to the cell line HEK293. the expression of H19 mRNA and the change in glocose metablism were observed.The transfection efficiency for the plasmid was higher than 90%.And after being transfected with target H19 gene, the expression of the mRNA level was significantly increased compared with that of control group. Let-7 level were unchanged between groups, while the let-7 target INSRβ、INS2 and LPL were rapidaly decreased, which induced glocose untolerance or GDM.Over-expression of H19 gene can suppress let-7 level or ability, than derepress the function of INRB and LPL.It provides the direct experimental evidence for regulating the glocose tolerance in pregnancy.

基因印迹是一种不遵从经典的孟德尔遗传规律的依靠单亲传递某些遗传学性状的现象，目前已成为遗传学领域的研究热点。其中H19作为发现最早的印迹基因之一，主要在人胎盘及胚胎组织中丰富表达，在成人组织中很少表达；而且有证据表明，H19在配子形成、胚胎的早期形成、着床以及生长发育过程中发挥了重要的生理功能，并与肿瘤的发生以及代谢性疾病的发生密切相关。妊娠期糖尿病是具有遗传倾向的一类妊娠相关性疾病，其严重影响到母儿结局，目前已成为产科研究的重点和热点。根据我们前期的研究结果推测H19印迹状态的改变或表达状态的改变，通过下游基因调控用于信号传导通路，最终可能引起这类代谢性疾病的发生和发展。因此，本研究利用动物模型和人类妊娠期糖尿病组织标本对H19的变化，及其下游miRNA等信号通路的改变，深入探讨H19对妊娠期糖尿病中的影响及其调控机制。

基因印迹是一种不遵从经典的孟德尔遗传规律的依靠单亲传递某些遗传学形状的现象，其中H19作为发现最早的印迹基因之一，主要在人胎盘及胚胎组织中丰富表达，有证据表明H19与肿瘤的发生和代谢性疾病的发生密切相关。妊娠期糖尿病是具有遗传倾向的一类妊娠相关性疾病，其严重影响到母儿结局。根据我们前期的研究结果推测H19印迹状态的改变或表达状态的改变，通过下游基因调控作用于信号传导通路，最终可能引起这类代谢性疾病的发生和发展。构建高脂饮食小鼠模型，提取动物骨骼肌组织，发现在高脂小鼠组织中，H19表达水平低于正常组，miRNA-let7表达水平高脂组高于正常组，而miRNA-let7的靶基因LPL、 INSR和IRS2在mRNA和蛋白水平在高脂组中均明显低于正常组。动物实验说明H19可能通过miRNA-let7参与糖脂代谢调控。分别在小鼠成肌细胞C2C12和人卵巢畸胎瘤细胞系PA-1中，通过细胞转染技术转染干扰RNA（siRNA）特异性敲除H19，以及转染反义链抑制剂iLet-7特异性阻断let-7结合靶基因，检测各组中H19、miRNA-let7以及miRNA-let7糖代谢相关靶基因LPL、INSRβ和IRS2的相对mRNA和蛋白表达水平。发现敲除H19后，miRNA-let7表达水平增高，下游靶基因LPL、 INSR和IRS2表达均下调；如敲除H19同时抑制miRNA-let7，下游靶基因水平不变。细胞实验说明H19通过吸附miRNA-let7，进而调控糖脂代谢酶类表达。选取同期入院的正常、孕期肥胖和妊娠期糖尿病并同孕周正常分娩的患者进行分析，采集胎盘组织，检测各组中人H19、miRNA-let7以及代谢相关靶基因LPL、INSRβ和IRS2的相对mRNA和蛋白表达水平。发现妊娠期糖尿病组中H19表达水平明显低于正常组和肥胖组，miRNA-let7水平在妊娠期糖尿病组中明显升高，其下游靶基因LPL、 INSR和IRS2表达水平在妊娠期糖尿病组中均明显低于正常组，而肥胖组和正常组无差异。临床实验说明H19同样可能通过miRNA-let7调控糖脂代谢靶基因，从而参与妊娠期糖尿病的发生和发展。通过细胞、动物和临床实验证明H19通过miRNA-let7调节其下游糖脂代谢相关基因LPL、 INSR和IRS2的表达，参与妊娠期糖尿病的发病，为妊娠期糖尿病早期筛查提供理论依据。