汉族先天性输精管缺如CFTR基因启动子区域突变及致病性研究

Mutation in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator(CFTR) gene is believed to be the most vital pathogenesis of isolated congenital absence of vas deferens (CAVD) as well as a major cause of cystic fibrosis(CF), which’s a deadly desease. While these two diseases’ mutant patern are crossing, there are risks that CF individuals borned from Caucasions CAVD patients, both in exons and promoter regions. Although the studies of CAVD in Chinese have found the same possibility that CF patients result from the inheritance of CFTR gene mutations in the exons region, no such report is published about the promoter region. Our former research had found mutations in the promoter region of the CFTR gene and they were proved to be CF-caused. We are going to keep exploring around the mutations in the promoter region of the CFTR gene in Chinese, intend to find out the crucial spots in Chinese CAVD patients. We also purpose to verify the function of the novel mutation using site-specific mutagenesistechnology, immunofluorescence, CHIP, EMSA and CRISPR Cas9 gene knockout technology, miRNA screening and verification assay, etc, which are essential for determining the pathogenesis of CAVD in Chinese patients and providing the genetics consulting when assisted reproductive technique performed.

CFTR基因突变既是单纯先天性输精管缺如(CAVD)最重要的病因，也可产生致死性囊性纤维化病(CF)。无论在外显子还是启动子区域，CFTR突变谱的交叉使高加索人单纯CAVD患者具有产生CF子代的风险。汉族单纯CAVD患者CFTR外显子区域突变也具有致CF遗传风险，但针对汉族CFTR启动子区域的研究尚无同行报道。我们前期研究证实汉族单纯CAVD患者也存在CFTR启动子区域突变并具有CF致病性。课题组拟进一步探索国人CFTR启动子区域突变，观察汉族CAVD患者CFTR启动子区域突变的关键位点。利用定点突变技术构建目的表达载体进行细胞株转染，免疫荧光检测表达蛋白定位、Chip、EMSA检测蛋白相互作用；应用CRISPR-Cas9基因条件敲除技术构建定向突变小鼠进行体内功能验证；筛选并转染miRNA进一步研究调控CFTR基因启动子的机制，为CAVD的发病机制研究及辅助生殖前遗传学评估提供理论依据。

项目背景：先天性输精管缺如（CAVD）是梗阻性无精症的重要病因。囊性纤维化跨膜转导调节因子（CFTR）是CAVD最重要致病基因，CFTR突变谱的交叉使高加索人单纯CAVD患者具有产生CF子代的风险。汉族单纯CAVD患者CFTR外显子区域突变也具有致CF遗传风险，但针对汉族CFTR启动子区域的研究尚无同行报道。.主要研究内容：我们前期研究证实汉族单纯CAVD患者也存在CFTR启动子区域突变并具有CF致病性。课题组拟进一步探索国人CFTR启动子区域突变，观察汉族CAVD患者CFTR启动子区域突变的关键位点。利用定点突变技术构建目的表达载体，应用CRISPR-Cas9基因条件敲除技术构建定向突变小鼠进行体内功能验证；筛选并转染miRNA进一步研究调控CFTR基因启动子的机制，为CAVD的发病机制研究及辅助生殖前遗传学评估提供理论依据。.重要结果、关键数据及其科学意义：.1、总结了276例先天性输精管缺如患者（CAVD）的CFTR基因的检测结果，初步建立了CFTR基因的突变谱并对频率较高的突变进行了功能评估，描绘了中国人群中CAVD患者的CFTR基因突变谱，发现至少检出一个突变的检出率高达72.46%，高于现有的文献研究统计结果。.2、研究检测出62种CFTR基因的突变，其中包括12个新突变，为基因突变库增加了重要的数据。5T突变为测出频率最高的突变，为27.54%，是CAVD患者中最为常见且重要的CFTR基因突变，此结论与目前国内研究相一。.4、在CFTR启动子区域找到一个新突变c.-195C>A，并完成该突变基因的质粒表达载体构建。通过荧光素酶检测实验，证实该新突变显著下调CFTR蛋白的表达量，体外功能学验证了其致病性。.5、通过对CFTR遗传致病的统计和计算，在国内提出适合我国汉族人CFTR突变谱的遗传筛查方式。.6、研究成果已产出论著，在遗传类经典SCI杂志GENE（IF：3.688）上发表2篇SCI论著，在中华医学杂志发表1篇论著。.7、基金支持下，发表了其他SCI论著（Translational andrology and urology，IF：3.150； The Journal of Sexual Medicine，IF：3.802）。.8、体外实验阶段，目前已应用Crispr-Cas9技术成功将CFTR基因敲除，可进行后续功能学研究实验。