特异腐质霉转录因子HiProA调控纤维素酶表达机制的研究

Humicola insolens is an excellent producer of neutral, thermostable cellulases that find many industrial applications. In the present study, we developed an efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation system for H. insolens. T-DNA insertional mutagenesis was employed to generate an H. insolens mutant library, and we isolated a transformant termed T1 with enhanced cellulase and hemicellulase activities. We isolated the sequences flanking the T-DNA insertions and thus identified HiproA potentially involved in cellulase and hemicellulase production. This proposal will study the function of HiproA involved in cellulase biosynthesis. We will use multi-biological methods and detection technology, such as gene disruption, genetic complementary, transcriptome analysis, ChIP-seq, EMSA and DNase 1 footprinting to reveal the its molecular mechanism in cellulase biosynthesis. This will be valuable when genetic improvement programs seeking to enhance cellulase production are planned, and will also allow us to gain a better understanding of the genetics of the thermophilic fungus H. insolens.

特异腐质霉具有强大的纤维素降解和纤维素酶分泌能力，因此在生物质能源、酿造工业、纺织工业及高效外源基因表达等领域具有良好的应用前景。但目前特异腐质霉的研究多停留于胞外酶的纯化和相关酶基因的克隆表达，尚未见纤维素酶表达调控相关分子机制的报道。申请人在成功构建特异腐质霉遗传转化及高效表达平台的基础上，通过随机插入获得了纤维素酶高产菌株。前期研究发现转录因子HiProA在其中起到重要的调控作用，但具体调控机制未知。本研究拟从转录因子HiProA的功能出发，利用基因阻断和回补等遗传学手段确定其与纤维素酶表达之间的关系，进而通过转录组分析、ChIP-Seq和体外生化实验揭示HiProA在纤维素酶表达调控中的具体作用机制。本研究将丰富对特异腐质霉以至丝状真菌纤维素酶表达调控机制的认识，同时也为高产工程菌株的构建奠定重要的理论基础。

特异腐质霉因其在生物质能源开发、酿造工业、纺织工业、及高效外源基因表达等领域的巨大应用前景而受到人们的广泛重视。但目前关于特异腐质霉的研究多停留在胞外酶的纯化和相关酶基因的克隆表达，鲜有纤维素酶表达调控、修饰、分泌相关分子机制的研究报道。申请人前期工作利用T-DNA随机插入突变的方法建立了特异腐质霉的突变体库，并从中筛选得到了纤维素酶高产突变株T4。为了全面解析T4菌株的纤维素酶高产机制，本项目采用第二代高通量测序技术，对野生型特异腐质霉和T4菌株在纤维素诱导培养不同时间条件下的转录组进行了深度测序。将特异腐质霉野生型和T4菌株在纤维素诱导培养条件下的显著差异表达基因进行KEGG pathway富集分析，差异表达基因最多的富集在了碳水化合物代谢途径、信号转导途径、转运和代谢途径中。我们将可能编码了转录因子的差异表达基因进行了筛选，鉴定得到可能在特异腐质霉纤维素酶表达调控过程中的发挥了重要作用的关键转录因子CreA、CreD、ACE1、WC1、LaeA和Pro1等。为了便捷实现特异腐质霉中的基因功能鉴定，我们在特异腐质霉中构建了CRISPR/Cas9基因组编辑系统，并在此基础上构建了碳代谢抑制核心转录因子creA基因敲除菌株。creA基因敲除导致特异腐质霉菌株在固体培养基中的菌落变小，菌丝明显增粗，暗示了creA基因在特异腐质霉菌体生长发育中的重要作用。creA的敲除对特异腐质霉的非诱导型外切葡聚糖酶，葡萄糖苷酶和木聚糖酶在葡萄糖存在条件下的转录表达具有重要的去抑制效果。在以微晶纤维素为碳源的发酵条件下，creA基因敲除却导致菌株的胞外总蛋白分泌量以及纤维素酶产量明显降低。这些结果暗示我们，在特异腐质霉中，碳代谢物响应因子CreA对于纤维素酶的表达具有特殊的双向调控机制。本项目深入探索了特异腐质霉突变株T4中纤维素酶高产的分子机理，丰富了我们对木质纤维素酶表达调控机制的认识，也为进一步改良菌株和构建高效的异源蛋白表达系统提供重要的理论和技术基础。