人类新基因MAFIP在帕金森病发生过程中的机制研究

Parkinson's disease (PD) is one of the most common neurodegenerative disease nowadays and the incidence is still increasing.The most typical pathological marks of PD is the presence of intracellular protein aggregates, known as Lewy bodies within the surviving nigral neurons. a-Synuclein (a-syn), E3 ubuquitin ligase CHIP, molecular chaperon HSP70 and BAG5 are major components of these protein inclusions.a-syn monomers can also self associate into soluble higher-order structures such as oligomers and confer significant toxicity to cells which may be modulated by chaperones and co-chaperones such as HSP70 and BAG5. In this process the ubiquitylation of a-syn by CHIP plays a crucial role. Our previous study found that the transcriptional product of human novel gene MAFIP can form a complex in the cell with CHIP, HSP70 and BAG5, which raised the possibility that MAFIP may affect the activity of E3 ligase CHIP involved in the process of Parkinson's disease. This study attempts to identify the interaction between MAFIP and CHIP, HSP70, BAG5 etc. in vitro and in vivo, explore if MAFIP is involved in the regulation of a-synuclein oligomerization in the cell, and cause what kinds of the cytological effects on the nerve cells.

帕金森病是一种当今临床常见且难以治愈的神经功能障碍疾病，其发病率还在逐年增高。研究发现在大脑黑质神经元内a-Synuclein与E3泛素连接酶CHIP，分子伴侣HSP70和BAG5等蛋白形成不溶的Lewy小体，是帕金森病的典型病理变化。同时a-Synuclein还会在细胞内自发形成可溶性的寡聚体，对细胞造成毒性。在此过程中CHIP的泛素连接酶酶活性受BAG5和HSP70的调控，对a-Synuclein进行泛素化修饰起了关键性作用。我们的前期研究发现人类新基因MAFIP可以在细胞内与CHIP，HSP70和BAG5形成复合体，故而推测其很可能影响CHIP的酶活而参与影响帕金森病的发生过程。本研究试图鉴定MAFIP与以上蛋白成员在体内和体外的具体相互作用，并确认其对CHIP酶活的影响机制，探索此蛋白在细胞内是否参与调控了a-Synuclein的寡聚化作用，最终对神经细胞的细胞学效应产生何种影响。

项目申请时的主要研究对象基因MAFIP在2012年5月被genebank数据库定义为假基因，我们因此调整了研究方向和策略，试图从非编码基因的角度进一步探索其功能。在对8种膀胱癌细胞株的RNA-seq，microRNA-seq和DNA甲基化MBD-seq组学结果的综合分析发现，MAFIP基因的表达很低，可能不具有实质的生物学功能。然而，在仔细比较这些对于临床化疗药物耐受度有较大差异的膀胱癌细胞（5637 vs H-bc）后发现，有一系列可能受到DNA甲基化调控的基因表达差异明显，可能参与调控膀胱癌化疗耐受机制。其中miR-193a基因在化疗敏感细胞系5637中表达较低，DNA甲基化水平较高，而在化疗耐受细胞系H-bc中表达较高，DNA甲基化水平较低。在细胞中转染其转录产物miR-193a-3p的mimic或antagomiR来上调或下调其表达水平后证明，miR-193a-3p的表达可以引起膀胱癌细胞对于紫杉醇，吡柔比星，阿霉素和表柔比星产生药物耐受，而另一转录产物miR-193a-5p对于化疗敏感性则无明显影响。miR-193a-3p的这一效应主要是通过对于DNA damage，NF-kB，myc/max，Oxidative Stress和Notch共5条信号转导途径的调控引起的。通过生物信息学分析与RNA-seq的组学结果综合分析筛选，我们共发现了miR-193a-3p可以通过直接抑制7个下游靶基因（PLAU，SRSF2，HIC3，LOXL4，ING5，PSEN1和HOXC9）的表达，发挥其在化疗耐受机制中的调控作用，这些下游基因对于不同化疗药物的耐受和不同信号途径活性的影响各有不同，共同产生了miR-193a-3p对于多种化疗药物耐受的综合效应。在裸鼠体内的成瘤-化疗处理实验也进一步证明了miR-193a-3p而不是-5p可以导致膀胱癌瘤体对于化疗药物产生耐受。我们的实验结果不仅明确了miR-193a-3p及其靶基因在膀胱癌化疗耐受中的机制和作用，也为预测临床膀胱癌的化疗反应，指导其药物的精准治疗提供了一系列有效的分子标记。