组蛋白去乙酰化酶抑制剂通过蛋白降解酶途径促进HIF-2α降解的分子机制

肿瘤内部低氧诱导HIF家族及其靶基因表达，在肿瘤侵袭转移中发挥重要作用。组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂可明显抑制肿瘤血管生成及代谢，其作用主要是通过HIFα靶点。我们前期工作发现，HDAC抑制剂可明显抑制骨肉瘤HIF-1α、HIF-2α及其靶基因表达；体内实验也证实HDAC抑制剂抑制HIF-2α表达；HDAC抑制剂通过蛋白降解酶途径促进HIF-2α降解，但具体信号传导通路尚未明确。本课题拟在体外模拟低氧下培养骨肉瘤MG-63细胞，构建PCMVflagHIF-2α质粒，细胞分别转染HIF-2α、HIF-2αPAS区缺失及HIF-2αODD区缺失质粒，Western Blot检测与HIF-2α降解有关功能区；免疫沉淀及siRNA技术检测HIF-2α降解与HSP90、HDAC6及HDAC4的关系，探讨HDAC抑制剂促进HIF-2α降解的信号传导通路，为HIF-2α为靶点肿瘤治疗提供理论依据。

当实体肿瘤生长的速度超过血管形成的速度时，就会产生一个相对缺氧的微环境。此时，激活缺氧诱导因子-1 (HIF-1)是肿瘤继续生长的重要条件之一。文献报道，HDACIs不仅可以降解HIF-1α蛋白，同时也抑制HIF-1α的转录激活作用。目前关于HDACIs对HIF-2α的作用机制尚无文献报道。本课题研究HDAC抑制剂对HIF-2α蛋白表达的影响；阐明HDAC抑制剂促进HIF-2α降解的信号通路。本实验通过体外模拟低氧环境培养骨肉瘤MG-63细胞， RT-PCR、western blot检测不同浓度的TSA对骨肉瘤MG-63细胞HIF-1α、HIF-2α、VEGF及Glut-1 mRNA、蛋白表达的影响。使用蛋白酶体抑制剂MG132处理后，western blot检测TSA对HIF-2α表达的影响。体外培养VHL基因缺陷的786-0细胞系，MG132处理后，不同浓度的TSA处理，western blot检测HIF-2α的表达情况。利用小分子RNA干扰技术下调HDAC4，HDAC6和HDAC7的表达，验证HDAC在TSA抑制HIF-2α中发挥的作用。建立裸小鼠骨肉瘤动物模型，分为TSA组、生理盐水组和CTX组，同时测量肿瘤直径及荷瘤鼠体重，绘制肿瘤生长曲线及裸鼠体重变化曲线；裸鼠处死后肿瘤组织提取蛋白，在体内研究TSA对HIF-2α表达的影响。实验结果显示体外低氧状态下，在培养的MG-63细胞系中，TSA呈浓度依赖性抑制HIF-1α、HIF-2α蛋白及靶基因VEGF和Glut-1 mRNA的表达；在蛋白酶体抑制剂MG132存在的情况下，可以逆转TSA对HIF-2α的抑制作用。在VHL基因缺陷的786-0细胞系中，TSA呈浓度依赖性抑制HIF-2α蛋白表达，MG132可以逆转TSA的作用。在动物体内，TSA抑制肿瘤的生长和HIF-2α表达。小分子RNA干扰技术敲除HDAC6降低HIF-2α蛋白表达。实际上HDAC6与HIF-2α相互作用， TSA处理后HIF-2α发生乙酰化。组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA在体内外均可明显抑制HIF-2α蛋白表达，并呈浓度依赖性，可作为抗骨肉瘤治疗新靶点。TSA可以通过VHL非依赖性的蛋白酶体依赖的途径抑制HIF-2α表达，TSA抗肿瘤作用至少部分是通过抑制HIF-2α介导的，为研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂抗肿瘤作用的分子机制提供了一个新的方向。