气体信号分子硫化氢对腰椎间盘髓核细胞凋亡影响的实验研究

腰痛是骨科临床治疗上的一大顽疾，大多数腰痛与椎间盘退变有关，新型气体信号分子硫化氢(H2S)在腰椎间盘组织中是否存在及其是否参与腰椎间盘退变目前国内外尚没有相关研究和报道，目前已有的H2S研究结果和我们的预实验让我们推测H2S可能存在于腰椎间盘中，并可能介导髓核细胞缺氧的调节以及对髓核细胞的凋亡产生调节作用。我们设计实验研究内源性H2S合成酶CBS与CSE在人退变腰椎间盘髓核细胞中的表达及与椎间盘缺氧状态、髓核细胞凋亡的关系，从而初步探讨内源性H2S对腰椎间盘退变的调节机制；研究外源性H2S对腰椎间盘髓核细胞凋亡的影响，尤其是对缺氧状态下髓核细胞凋亡的影响，从而为腰椎间盘退变治疗寻求新的治疗靶点。

本课题首先研究内源性硫化氢合成酶在突出椎间盘髓核组织中的表达情况及其与髓核细胞缺氧和凋亡之间的关系。选取腰椎间盘突出症而行后路手术切除的椎间盘髓核组织分为包含组和非包含组；通过免疫组化研究CBS、CSE及HIF-1a在不同椎间盘突出类型髓核细胞中表达的情况；通过TUNEL染色研究髓核细胞凋亡的情况,发现腰椎突出椎间盘组织中表达内源性H2S合成酶CBS和CSE，并且其表达与突出类型、HIF-1a表达和髓核细胞凋亡相关。.然后研究硫化氢对缺氧诱导的大鼠髓核细胞凋亡的调节及其相关机制，取原代培养、差速贴壁法纯化的第3代大鼠腰椎间盘髓核细胞，免疫荧光、检测内源性硫化氢合成酶CBS和CSE在髓核细胞内的表达和定位；建立缺氧细胞模型及外源性硫化氢干预细胞模型分为：1.对照组；2. NaHS组；3.低氧组；4.低氧+NaHS组，连续观察细胞的变化、CCK-8细胞计数、Annexin V-FITC细胞凋亡检测；Western-Blot检测Caspase-3表达变化。证实外源性H2S能部分抑制缺氧诱导的髓核细胞凋亡。.之后研究外源性H2S对肿瘤坏死因子-α（TNF-α）促体外培养椎间盘髓核细胞凋亡过程的影响。体外培养正常3月龄新西兰大白兔髓核细胞传代至第3代，分为6组：正常对照组﹑NaHS处理组﹑内源性硫化氢合成酶抑制剂（PPG）处理组﹑TNF-α处理组﹑TNF-α+PPG处理组﹑TNF-α+NaHS处理组。采用免疫荧光染色检测CBS及CSE在正常未处理髓核细胞内的表达。采用Western blotting法检测Bcl-2﹑PARP﹑Bax表达变化，并检测Caspase 3活性。证实外源性H2S可以部分拮抗TNF-α诱导的髓核细胞凋亡。.最后研究内源性H2S体系在针刺损伤椎间盘退变模型中的表达变化。将新西兰大白兔椎间盘退变模型分为实验3周组﹑6周组及12周组，采用HE染色研究椎间盘组织病理学变化，采用Realtime-PCR法研究IIa型胶原及Aggrecan mRNA相对表达量。采用免疫组化及Western-Blot方法检测CBS和CSE在髓核细胞内的表达变化，用敏感硫电极法测定各组H2S产率,采用Western-Blot法检测Bcl-2﹑PARP﹑Bax表达变化。发现针刺纤维环损伤椎间盘退变模型中，细胞凋亡相关蛋白与内源性H2S体系表现出同步的变化趋势。