调控流感病毒与宿主细胞识别的传统中药活性成分及其分子机制研究

Drug development targeting virus entry is an efficient approach to overcoming drug resistence caused by mutations of RNA viruses. The previous study found that saponins from Cynanchum glaucescens, Cynanchum atratum, Radix isatidis and Dipsacus asper Wall significantly inhibited the viral entry, including influenza virus, HCV, and so on. The pentacyclic triterpene obtained by subsequent isolation also exhibited strong anti-viral activity, indicating that the saponins from traditional Chinese medicine (TCM) are potential drugs capable of preventing viral entry into target cells. In this project, we will isolate and identify active compounds from TCM which strongly inhibit highly pathogenic influenza virus based on the pseudovirus system, adopt the biotin-label technology to find the target protein, use HA assay to analyze the inhibiting effect of active compounds on virus-host cell interaction, and utilize the polykaryon assay to examine the virus-cell fusion inhibitory activity of the drugs. We will perform various molecular biology experiments to discover the mechanism of anti-virus activity of such drugs, especially the mechanism to the regulation of drugs on the recognition between virus and host cells via interaction between viral and cellular proteins. Then, we will examine whether the drugs are broad-spectrum antivirals targeting entry of enveloped virus, such as influenza virus, HIV, and HCV, using the pseudoviruses. This study will provide clues for developing antiviral drugs with high efficiency, low toxicity, and broad-spectrum, help us to understand the mechanism of TCM antiviral activity, and be valuable for identification novel drug targets.

以病毒进入细胞为靶点的抗病毒药物研究，是克服和延缓RNA病毒自身基因高突变带来耐药性的有效途径。前期工作表明白前、白薇、板蓝根和川续断的醇提物的正丁醇部位可显著抑制流感病毒和丙肝病毒进入细胞，进一步分离出的某些五环三萜类苷元也表现出一定的抑制活性，显示出皂苷类物质在抑制病毒进入细胞方面的应用前景。我们将继续借助高致病性流感病毒假病毒感染模型，追踪和分离传统中药中抗高致病性流感病毒的活性成分（群），并利用生物素标记活性成分、病毒血凝素（HA）与细胞结合试验、以及HA与细胞融合试验等现代生物学方法揭示皂苷类药物的抗病毒作用靶蛋白和分子机制，尤其在天然物质调控蛋白-蛋白相互作用从而调控病毒与宿主的识别机理方面。同时，利用已建立的假病毒筛选系统，研究活性成分对其它种属病毒的广谱抗病毒作用。本研究对于研制高效、低毒、广谱的抗病毒药物，阐明传统中药抗病毒作用机理及新药物靶点的发现都具有重要的意义。

以病毒进入细胞为靶点的抗病毒药物研究是克服和延缓RNA 病毒自身基因高突变带来耐药性的有效途径。本研究工作从能显著抑制流感病毒进入细胞的川续断及白前等中药的正丁醇出发，分离出了刺囊酸及齐墩果酸等五环三萜并进行了一系列的结构修饰，包括C-28糖基化修饰、A环及C环的氧化开环、基于环糊精骨架的多价修饰等，同时运用经典毒株WSN活病毒感染模型进行了快速筛选，发现了具有较好抗流感活性的五环三萜-半乳糖苷新衍生物（IC50 = 14.2 μM），并进一步运用加药时间点试验、血凝抑制试验，病毒吸附细胞实验、融合试验、表面等离子共振实验、计算机辅助药物设计等技术，对其作用机制进行了研究，发现源于中药的五环三萜类化合物主要作用于血凝素（HA蛋白）（KD = 6 μM），抑制流感病毒与唾液酸受体的结合，从而阻断具有抗流感病毒进入的。不仅如此，该类化合物还具有抑制其他流感亚型如H3N2及B型流感病毒的广谱抗流感活性，经六代传代后仍不会诱导病毒产生耐药性，进一步的体内活性评价表明该类化合物可以在一定程度上保护小鼠不受病毒的感染。此外，结合抗流感活性的快速跟踪，本研究还对白前中药的抗流感活性成分（包括总皂苷、乙酸乙酯相及正丁醇相）进行了单体的分离，目前已经完成乙酸乙酯相中十余个含脱氧糖的C21多糖苷或其寡糖类化合物的分离，进一步正丁醇相的单体化合物的分离及抗流感活性的研究仍在进行中。本项目相关研究申请国内及国际专利各一项，在Biomaterials, J. Med. Chem.及Eur. J. Med. Chem.共发表研究论文3篇（影响因子之和为17.374），中文综述1篇，参加国际会议1人次，参加国内会议并做分会报告3人次，并获2015年中国药学会优秀论文二等奖1次。