生长素响应因子CsARF8-2响应茶树干旱胁迫的分子机理研究

Tea (Camellia sinensis (L.) O. Kuntze) is one of the most important economic crops in the world. With global warming in recent years, drought has become an important limiting factor for tea production. Auxin response factors (ARFs) play an important role in plant growth and development. But whether ARF play a role in drought stress is unknown. In the preliminary study, we confirmed that CsARF8-2 response to drought stress by analyzing the transcriptome data and real-time PCR. Additionally, the expression of CsARF8-2 is different among tea cultivars with different drought tolerance. On this basis, we will further analyze the time-space expression of CsARF8-2 in a variety of tea cultivars with different drought tolerance in both RNA and protein level. We will also clone the ORF and promotor sequences of CsARF8-2, and express them in the model plant Arabidopsis thaliana, to examine the time-space expression of CsARF8-2 in drought stress, compare the phenotypes between wild type and transgene plants and measure some related physiological signs. This study will elucidate the mechanism of CsARF8-2 in response to drought stress in tea plant and provide new clues for breeding drought-tolerant tea varieties.

干旱严重影响茶叶的产量和品质，研究茶树耐旱机制对茶叶生产具有重要意义。生长素响应因子（auxin response factor，ARF）在植物生长发育的多个过程中发挥重要作用，但它是否在干旱胁迫中起作用却鲜为人知。在前期的工作中，我们通过分析干旱胁迫及复水后的转录组数据及荧光定量PCR，发现CsARF8-2变化显著，且在耐旱性不同的茶树品种中的表达明显不同。本项目拟在此基础上，利用已获得的独特材料，从RNA和蛋白质水平上分别研究CsARF8-2在耐旱性不同的茶树品种中的时空表达规律。同时，克隆CsARF8-2的基因全长及启动子序列，发展拟南芥转基因株系，分析该基因在干旱胁迫不同时间点的时空表达及过表达植株在干旱胁迫及复水下的表型及生理特征，探索CsARF8-2响应茶树干旱胁迫的分子机制，为培育茶树耐旱新品种提供线索。

近年来，我国茶园干旱灾害频发，对茶叶生产造成不良影响，研究茶树耐旱机制对茶叶生产具有重要意义。生长素是重要的植物激素，越来越多的研究表明其参与植物干旱胁迫响应，而生长素响应因子作为生长素信号转导途径中的核心元件，在植物生长发育的多个过程中发挥重要作用，但它是否在干旱胁迫中起作用却鲜为人知。本研究基于茶树基因组和转录组测序结果，克隆获得茶树生长素响应因子CsARF8-2的cDNA和启动子序列，并对其进行生物信息学分析。结果表明，CsARF8-2开放阅读框长度为2496bp，编码831个氨基酸，具有典型的B3-DBD、Auxin_resp和CTD结构域，启动子区包含激素、胁迫和光响应元件。对龙井43等4个品种两年生盆栽扦插茶苗进行自然干旱处理，通过测定自然干旱胁迫后茶树叶片相对含水量、丙二醛含量、抗氧化物酶活性、净光合速率和色素含量，利用耐旱性隶属函数值分析法比较品种间耐旱性关系。结果表明，4个品种耐旱性从强到弱依次为龙井43、宁州2号、槠叶齐和白叶1号。利用实时荧光定量PCR分析CsARF8-2在干旱胁迫后的表达模式，表明干旱胁迫诱导CsARF8-2下调表达，且茶树品种耐旱性越强，其表达量下降程度越高。利用实时荧光定量PCR和组织化学染色法分析了CsARF8-2的组织特异性表达，结果表明，不同发育时期CsARF8-2表达不同，该基因主要在茎、花、嫩叶及角果中表达。构建35S::CsARF8-2::GFP融合表达载体，分别通过农杆菌介导的烟草叶表皮细胞的瞬时侵染以及遗传转化拟南芥子代根部直接观测法检测其亚细胞定位。结果表明，CsARF8-2定位在细胞核。发展了CsARF8-2 过表达的拟南芥转基因材料，分别对野生型及转基因阳性苗进行干旱胁迫及复水，以及进行ABA敏感性分析试验，均未观察到转基因阳性苗与野生型拟南芥有明显差异，表明CsARF8-2过表达并不能提高或降低植物耐旱能力。本研究为茶树耐旱机制及生长素通路研究提供了一定的研究基础。