具有肌肽合成活性的新型印迹酶分子构建及其稳定化研究

Carnosine （β-Ala-His）is a well knowned metal ion chelator, immunomodulator, neurotransmitter and anti-tumour agent which shows the excellent antioxidant and free-radical scavenging activities. Lipase are widely used as catalysts for β-peptides synthesis. However, in the synthesis of carnosine,the substrate can not be easily bonded to the active-site of enzyme which limits the synthesis activity of lipase. Therefore, in this project, a novel bio-imprinted enzyme with carnosine synthesis activity (CSA-Im) will be constructed on the base of lipase molecule through the induction of template which will oblige lipase to adopt a specific conformation to bind the substrates. In this study: (1) Molecular simulation and "Quantitative Structure-Activity Relationship" analysis will be combined to establise a "template structure- enzyme conformation- substrates affinity" model so as to rationally design the template for bio-imprinting. (2) The bio-imprinting will be carried out by adding this template to lipase solution, and the process will undergo the "induction-dehydration-washing" steps. (3) Due to the poor stability of imprinted enzyme in aqueous media, the cross-linking modified method will be used to improve the bio-imprinting technology, and the modified CSA-Im will be finally applied in the preparation of bioactive carnosine.(4) In this project, molecular simulation, statistical analysis and the "multi-scale" analysis stratgy will be combined to give a deeper comprehension on the relationship between enzyme structure and its catalytic activity. Meanwhile, some methods and results will be benificial for the further research on bio-imprinting technology and the development of new biocatalyst.

脂肪酶是催化非天然氨基酸肽合成的重要用酶，然而在生物活性肌肽(β-Ala-His)的合成中，其对底物的专一性差、结合力弱，限制了催化活性的发挥。基于此，本项目利用生物印迹技术，通过合理设计模板分子，诱导脂肪酶产生能专一性结合底物的构象，构建新颖的具有肌肽合成活性的印迹酶分子，解决肌肽合成中遇到的问题。研究中(1)结合分子模拟和定量构效关系方法，建立"模板分子结构-酶活构象-酶对底物结合能"关联模型，理性设计模板分子；(2)利用此模板对脂肪酶进行诱导、印迹，得到新型印迹酶分子；(3)进一步，将交联化修饰引入生物印迹过程，以克服传统印迹酶在水相介质中稳定性差的缺陷，真正实现印迹酶在肌肽合成反应中的应用；(4)综合运用多种分析测试手段，多尺度表征印迹酶，深入揭示印迹酶分子结构与催化特性之间的关系。本项目的研究方法和研究成果可为其他新型印迹酶分子的构建、稳定化及生物催化应用提供理论指导和技术借鉴。

脂肪酶是工业生产中的重要用酶，在精细化学品合成与拆分中广泛应用。然而，对于某些特殊反应，天然脂肪酶的选择性较低，催化效率不高，限制了该酶的广泛应用。基于此，本项目应用生物印迹方法，通过计算机模拟筛选模板分子，实验诱导天然脂肪酶产生能选择性催化底物的构象，构建新颖的印迹脂肪酶分子，同时针对印迹酶易于聚集，分散性和稳定性差的缺陷，提出生物印迹酶纳米微囊的制备新工艺。此外，本研究还创新性地将印迹方法与肽组装相结合，利用印迹模板分子与连接催化基团的短肽分子的相互识别作用，构筑了具有脂肪酶活性的人工仿酶。具体研究中：（1）以构建具有R/S-苯乙醇拆分活性的印迹脂肪酶为模型体系，利用柔性分子对接和分子动力学方法模拟多类印迹模板对天然脂肪酶的结合和诱导作用，得到印迹酶分子构象，随后再次利用刚性分子对接程序，模拟印迹酶分子对底物R/S-苯乙醇的选择性催化过程，最终由打分函数结果判定印迹酶的拆分选择性；（2）通过实验对模拟结果进行验证，结果证明，印迹酶的活性和选择性相比天然酶均有大幅提高，且与模拟结果一致，结构研究表明，印迹酶表面呈多孔道分布，印迹过程令脂肪酶二级结构发生明显改变；（3）将生物印迹脂肪酶应用于R/S-苯乙醇拆分反应中，优化了反应条件，最终转化率达 43.2%，E>2000，接近拆分极限，且具有较高的重复利用性；（4）针对印迹酶在有机体系中分散度低、易聚集的缺陷，利用壳聚糖-三聚磷酸钠包埋，优化制备了生物印迹酶纳米微囊，所制得的微囊粒径均一、分散度好、稳定性高、活性进一步提高。（5）以短肽Fmoc-FFH、Fmoc-FFS、Fmoc-FFD为基本构筑单元，通过共组装将天然脂肪酶催化三联体氨基酸引入纳米纤维中，得到具有水解活性的共组装人工仿酶，通过优化制备条件，得到了具有高催化活性、高度规则的纳米纤维，揭示了纤维组装程度与酶活的关系；（6）为了提高人工水解酶的催化效率，将分子印迹方法与双亲短肽共组装过程结合，在肽组装过程中，利用模板分子诱导形成对底物分子具有识别功能的活性中心，通过条件优化，成功制备得到了分子印迹-共组装人工水解酶，有效提高了人工水解酶的催化活性。.研究成果共发表SCI论文7篇，培养博士生1人，硕士生5人，参加国内外学术交流及会议6次，做口头报告/墙报3次，获得2013年度天津市自然科学二等奖1项。