若尔盖高寒湿地甲烷排放的功能甲烷菌及其生物学特征

高寒湿地对全球的甲烷排放具有重要贡献。若尔盖沼泽的年平均气温为0.6-1.2℃，原位观测证明该湿地是青藏高原甲烷排放的活跃区之一，表明土壤中生活着活跃的低温微生物、尤其是低温甲烷菌。近年来国际上对高纬度高寒湿地的甲烷排放途径和功能甲烷菌研究很多，本项目拟以低纬度的若尔盖湿地为对象，采用分子生态学手段分析该湿地两种主要植被土壤中的优势甲烷菌组成；通过培养手段获得优势甲烷菌，阐明它们的代谢和生理学特征；通过阻断湿地土壤的甲烷合成过程，分析原位土壤的甲烷排放途径和规律；并结合优势甲烷古菌的生理学，确定在湿地甲烷排放中的功能甲烷菌；选择在湿地甲烷排放中发挥重要功能的甲烷菌为研究材料，探讨它们的冷适应机制，阐明其在高寒湿地活跃的本质。项目预期阐明若尔盖低温湿地的甲烷排放途径和规律,为控制温室气体提供理论依据；同时获得低温甲烷古菌，为低温甲烷发酵技术的应用储备菌株资源和技术指导。

若尔盖湿地是青藏高原甲烷排放的活跃区之一，本项目拟通过研究该湿地中优势的产甲烷古菌、代谢途径及其环境影响因子，阐明若尔盖湿地甲烷排放途径和规律,为控制温室气体提供理论依据。.本项目获得如下进展：1）证明甲烷八叠球菌和甲烷微菌是若尔盖湿地的优势产甲烷古菌；2）证明土壤古菌的群落组成与植被类型相关，而与温度无关；3）通过湿地土样从各种底物的产甲烷速率、优势甲烷菌组成及产甲烷前体物质积累，证明甲醇产甲烷是若尔盖湿重要的甲烷排放途径; 4）获得了50多株甲烷古菌，发表2个甲烷古菌新种：嗜冷甲烷叶菌（Methanolobus psychrophilus）R15和嗜低氢的甲烷微菌新种--食氢甲烷袋菌（Methanoculleus hydrogenotrophus）;定量PCR证明它们分别是刚毛荸荠和木里苔草根际的优势产甲烷古菌；5）RNA-seq分析罕见的嗜冷甲烷古菌R15在18℃和4℃转录谱，发现其低温响应的基因谱包括细胞表面蛋白、遗传信息传递系统、甲烷合成途径和细胞生物质合成途径；RNA降解相关的exosome的基因簇在低温下上调表达，表明低温下RNA的代谢活跃。6）首次证明甲烷古菌的群感效应调控系统所调控的生理过程：竹节状甲烷鬃菌6Ac分离于厌氧废水处理器，而且细胞形态的变化与细胞密度相关。基因同源性及功能分析证明甲烷菌6Ac的filI基因编码AHL信号分子合成酶FilI。化合物结构分析（LC-MS、高分辨质谱、NMR）证明FilI蛋白合成新结构的高丝氨酸内酯（AHLs）--羧基高丝氨酸内酯（carboxyl-AHLs）。生理学实验证明羧基高丝氨酸内酯参与调控细胞的形态变化及碳代谢流。Microarray分析表明长链细胞的甲烷合成途径的起始酶基因显著上调表达，而细胞碳合成途径的基因下调表达，与生理现象一致。菌株6Ac的基因组含细菌的群感效应luxI-luxR的同源基因--filI-filR调控系统。其它甲烷菌中也存在羧基AHLs及filI同源基因。该研究说明群感效应在原核生物中普遍存在；并且该发现可用于激发甲烷鬃菌形成长链细胞，促进厌氧污泥颗粒的形成—厌氧反应器高效运行的基础；7）通过基因组学、分子生物学和同位素示踪手段，首次证明CO2还原产甲烷途径在甲烷古菌中的新功能—合成还原当量。研究结果发表论文12篇，SCI论文10篇。培养研究生11名。做国际学术会议大会报告2次。