放疗后肝脏微环境变化对肝实质细胞放射敏感性影响的机制研究

Radiotherapy (RT) is recommended as a treatment strategy for stage III hepatocellular carcinoma (HCC) by the Chinese Society of Liver Disease. Radiation-induced liver disease (RILD) is a fatal complication that restricts the therapeutic effect of RT. In a previous study, we showed that irradiated hepatic nonparenchymal cells release some cytokines that play an important role in sensitization of hepatic parenchymal cells. The hepatic microenvironment influences the radiation sensitivity of hepatic parenchymal cells. We established a protocol to study how changes in the microenvironment of irradiated liver may influence uninfected and hepatitis B virus (HBV)-infected hepatocytes. The design is such that it may be possible to elucidate factors playing key roles in RILD by bioinfomatic analysis. Major objectives will be identifying proteins closely associated with radiation sensitization of hepatic cells and determining differential cytokine profiles between post-irradiated uninfected versus HBV-infected liver. We will focus on the proteins or cytokines related to possible signal transduction pathways that may affect hepatocyte apoptosis or liver injury. With this approach, we hope to devise targeting strategies for RLID prevention or treatment.

《中国肝癌诊治指南》已经推荐Ⅲ期患者接受放疗，放射性肝损伤（RILD）是继发于肝脏放疗的致死性并发症，制约放疗效果的提高。我科前期的研究已证实肝脏受辐射后非实质细胞释放的细胞因子提高肝实质细胞的放射敏感性，即RILD与其肝细胞所处的微环境有重要关系。我们拟通过生物信息学技术研究放疗后肝脏微环境的变化对肝细胞及乙肝病毒感染的肝细胞影响，以及它们在RILD发生发展中的相互作用及调控机制。期望能筛选出与肝细胞放射敏感性密切相关的蛋白，放疗后正常肝脏释放的细胞因子以及病毒感染的情况下释放细胞因子的差异，它们与肝细胞凋亡、肝脏损伤相关的信号传导通路，为今后预防、治疗放射性肝损伤提供有意义的"靶点"。

放射性肝病(RILD)是阻碍肝癌放疗疗效提高的主要并发症。Toll样受体4(TLR4)在肝损伤和乙型病毒性肝炎等疾程中起重要免疫作用。另外，作为细胞周围的一种特殊微环境，肝脏组织间隙液（TIF）在肝损伤过程中起着细胞间信息通讯的重要作用。因此，TLR4免疫对RILD影响,及该过程中肝TIF改变值得进一步研究。首先，使用TOMO给予30只小鼠肝脏阶梯剂量放疗20天后处死小鼠，行肝脏及危及器官病理检测，发现小鼠全肝接受单次放疗剂量≥31.76±1.94Gy时可以建立小鼠RILD模型；确立了相关危机器官的放疗剂量限量，例如: 肝: 平均剂量 ≤26.36±1.71Gy；胃肠道，最大剂量≤22.63Gy等。进而，用高压水注射法经尾静脉将pAAV/HBV质粒注入TLR4缺陷（TLR4－）的C3H／HeJ小鼠体内，制作小鼠乙型肝炎病毒感染模型；将感染和不感染HBV的TLR4－小鼠使用TOMO予以全肝30Gy放疗，采用RT-RCR等方法检测检测HBV DNA拷贝数，放疗20天后对肝脏行病理检测等，结果发现：放疗可以促进HBV放疗后活化；但无论有无HBV放疗后活化，TLR4－小鼠全肝30Gy放疗未出现显著RILD；但对照TLR4－小鼠，给与TLR4正常（TLR4+）的C3H/HeN小鼠全肝30Gy放疗后发现TLR4+小鼠出现显著RILD；接着，回顾分析肝癌放疗后行手术切除的中山医院患者（共28例）的病史及病理资料，发现TLR4高表达的癌旁肝组织的RILD也高，并且TLR4高表达可以抑制肝脏放疗后HBV活化；最后，以肝TIF为研究对象, 将 TLR4－和TLR4+小鼠全肝30Gy放疗20天后提取肝脏TIF后行细胞因子芯片检测，分离培养TLR4－及TLR4+小鼠肝细胞，照射后8Gy 后与提取的TIF交叉共培养，流式细胞仪进行肝细胞的凋亡相关检测，结果发现：TLR4通过提高TIF（即肝脏微环境）中GM-CSF, VEGFR-2和TRAIL的表达促进RILD。总之，小鼠全肝单次剂量≥31.76±1.94 Gy放疗可诱导显著放射性肝损伤；促进RILD的关键因素是TLR4免疫，而非HBV放疗后活化；并且，TLR4通过提高TIF（即肝脏微环境）中GM-CSF, VEGFR-2和TRAIL的表达促进RILD。这些说明：抑制TLR4及相关细胞因子可以防止或减轻RILD，促进放疗治疗肝癌等腹部肿瘤。