LncRNA KCNQ1OT1通过miR-22靶向调控Fas/FasL影响糖尿病胰岛β细胞凋亡的研究

Type 2 diabetes has already been one of the major chronic diseases with serious harm to human health, insulin is an important hormone for regulating blood glucose concentration, insulin resistance and β cells damage are the main etiological factors of diabetes so far. Combined with molecular epidemiological methods, and on the basis of previous research results that nine miRNAs were been found which different expressed in diabetic peripheral blood, we proposed a hypothesis that lncRNA KCNQ1OT1 could affect islet β cells apoptosis through miR-22 target regulating Fas/FasL with biological information and experimental technology, then we plan to do it on celluar level, animal level and population level. We will repeatedly verify this hypothesis using Real-time PCR, western blot, luciferase report gene assay, RNA pull-down assay, cells apoptosis assay and so on, then comprehensive analysis three level research results of population, cell and animal, finally clarify if lncRNA KCNQ1OT1 could influence diabetes islet β cells apoptosis through miR-22 target regulating FasL, and which may provide a new therapeutic basis and clues for the molecular diagnosis and new therapeutic targets of diabetes.

2型糖尿病已成为严重危害人类健康的主要慢性病之一，胰岛素是人体内调节血糖浓度的重要激素，胰岛素抵抗、β细胞受损等是目前已知的主要发病因素。 本课题结合分子流行病学方法，在课题组前期研究发现糖尿病人外周血中存在差异性表达的9个miRNAs的基础上，运用生物学信息学和实验技术，提出了lncRNA KCNQ1OT1通过miR-22靶向调控Fas/FasL影响胰岛β细胞凋亡的假设，并计划从细胞水平、动物水平及人群水平进行研究。课题组将采用实时定量PCR、荧光素酶报告基因、RNA下拉试验、免疫印迹试验、细胞凋亡试验等进行反复验证，综合分析人群、细胞和动物三个层次的研究结果，最终阐明lncRNA KCNQ1OT1是否能够通过调控miR-22靶向作用于FasL影响胰岛β细胞凋亡及其分子机制，为糖尿病的分子生物学诊断及新的治疗靶点研究提供理论依据和线索。

目前，中国已成为世界上糖尿病患病人数最多的国家之一。2型糖尿病正时刻威胁着我国居民的健康，造成了沉重的社会经济负担。然而，糖尿病的发病机制尚未明确。胰岛素是人体内调节血糖浓度的重要激素，胰岛素抵抗、β细胞受损等是目前已知的主要发病因素。本课题结合分子流行病学方法，运用基因芯片、实时定量PCR、荧光素酶报告基因、RNA下拉试验、IP实验、免疫印迹试验、细胞凋亡试验、动物建模、基因敲除等方法，从人群、细胞和动物三个层面展开研究：1）找寻差异表达的lncRNA KCNQ1OT1和miR-22，并预测下游靶基因FASL 3’UTR区；2）运用大样本人群验证，T2D人群中lncRNA KCNQ1OT1表达增加，而miR-22表达降低；3）在细胞系中过表达lncRNA KCNQ1OT1可引起miR-22表达降低，而FASL蛋白表达增加，而干扰lncRNA KCNQ1OT1后，结果则相反；4）构建FASL 3’UTR区野生/突变型质粒并转染后，突变型表达高于野生型，在野生型中再转入miR-22抑制剂后表达增加；5）通过IP实验，过表达lncRNA KCNQ1OT1和miR-22后，Ago2蛋白表达均显著升高；通过Western blot实验，过表达lncRNA KCNQ1OT1后，Ago2表达显著增加，而干扰lncRNA KCNQ1OT1后，Ago2表达水平显著下降；6）构建lncRNA KCNQ1OT1的miR-22结合位点野生/突变型质粒，过表达lncRNA KCNQ1OT1后，miR-22表达降低，而干扰lncRNA KCNQ1OT1后，结果则相反；7）过表达lncRNA KCNQ1OT1可引起FasL及下游凋亡相关基因Caspase 8及Caspase 3的mRNA及蛋白表达均增加，且细胞发生凋亡；而复加入miR-22后，该效应均有所减弱；8）构建糖尿病鼠模型，大鼠胰岛细胞lncRNA KCNQ1OT1表达增加，而miR-22表达降低，FasL及下游凋亡基因表达均增加；9）构建lncRNA KCNQ1OT1敲除鼠模型，miR-22表达量高于正常造模鼠，而发生糖尿病及胰岛β细胞凋亡的比例较少。上述结果阐明lncRNA KCNQ1OT1通过调控miR-22靶向作用于FasL影响胰岛β细胞凋亡及其分子机制，为糖尿病的分子生物学诊断及新的治疗靶点研究提供理论依据和线索。