Endophilin2在神经元突触后膜对AMPA受体内吞的作用及机制研究

Endophilin is one of the important regulatory proteins, which plays a key role in recycling the synaptic vesicle at presynaptic membrane. Endophilin is enriched in both the pre- and postsynaptic membrane. Our previous study showed that endophilin2 is a calcium binding protein. It has two distinct modes or conformations, an open mode at low Ca2+ concentration and a closed mode at high Ca2+ concentration. Modal switching by Ca2+ allows endophilin2 to regulate synaptic vesicle endocytosis more effectively when neurons depolarize. The exact role of endophilin on postsynaptic membrane is not well understood, compared with it on presynaptic membrane. Recently, we have found evidence that the open mode of endophilin2 reduced the NMDA induced endocytosis of AMPA receptors in postsynaptic area. The regulation of AMPA receptors endocytosis is a major mechanism underlying long-term potentiation (LTP) and long-term depression (LTD), which closely related with learning and memory. So we intend to use molecular biology techniques, whole-cell patch clamp, immunostaining and co-immunoprecipitation to study the molecular mechanism of endophilin2 on AMPA endocytosis, and further more by using the electricphysiological technology to confirm the effect of endophilin2 on LTP and LTD. Thus,we can have a further understanding on the role of endophilin on synaptic plasticity, at the same time, provide some experimental evidence for therpy and drug development of some nervous system disease associated with learning and memory.

Endophilin是神经元突触前膜突触囊泡内吞过程中一个重要的调节蛋白，在突触前后膜均有分布，我们前期的研究发现endophilin2同时还是一个钙结合蛋白，在低钙和高钙浓度状态下呈现开放和关闭两种模式，其能在神经元去极化时通过两种模式的转换调控突触囊泡的回收。但对其在突触后膜的作用知之甚少，近期我们的研究表明在神经元突触后膜，endophilin2的开放模式减弱了经NMDA诱导的AMPA受体的内吞，AMPA受体内吞的调节与学习和记忆的重要机制--长时程增强（LTP）和长时程抑制(LTD)密切相关。为此，我们拟利用分子生物学、细胞膜片钳、免疫荧光、免疫共沉淀等技术研究endophilin2调控AMPA受体内吞的分子机制，并进一步采用脑片电生理的方法验证其对LTP/LTD的影响,以期深入理解该蛋白在突触后可塑性中的作用, 为与学习和记忆相关的神经系统疾病的治疗和药物开发提供一定的实验证据。

网格蛋白（clathrin）依赖型内吞是真核细胞内在化营养成分、抗原、生长因子、受体和囊泡的重要机制之一。Endophilin是网格蛋白依赖型内吞中的重要成员，其三个亚型endophilin1、endophilin2和endophilin3均在中枢神经系统表达，并且在神经元突触前后膜均有分布。以往的研究多关注endophilin在突触前突触囊泡内吞中的作用，而对其在突触后受体内吞中的作用知之甚少。本项目通过pulldown、免疫共沉淀、免疫荧光、细胞膜片钳、分子生物学等手段研究了endophilin其中的一个亚型endophilin2在突触后膜AMPA受体内吞中的作用和机制，发现了endophilin2对组构性的AMPA受体内吞不存在影响，而对NMDA及β淀粉样蛋白（Aβ）介导的活性依赖性的AMPA受体内吞具有调控作用，干扰endophilin2的表达可以缓解Aβ介导的AMPA受体的功能减弱。体外的pulldown、coIP实验及体内的免疫荧光共定位实验证实了endophilin2与AMPA受体其中的一个亚单位GluR1存在相互作用，并且明确了endophilin2与AMPA受体GluR1亚单位具体的结合部位为121-303aa处，而干扰endophilin2的表达可明显抑制Aβ介导的神经元表面GluR1的内吞，这些结果有望为与学习和记忆相关的神经系统疾病的治疗和药物开发提供一定的实验证据。研究还发现endophilin的三个亚型在突触囊泡内吞中也发挥着不同的作用，通过分别特异性干扰endophilin的三个亚型，我们在体外培养的大鼠海马神经元上利用双全细胞膜片钳执行不同的刺激方案，原创性地发现了endophilin三个亚型中在突触囊泡内吞中发挥功能的是endophilin1和endophilin2两个亚型，而不是endophilin3，为研究亚型特异性功能提供了重要的依据。