GhWRKY28和GhWRKY28-like共同调控棉花对大丽轮枝菌的抗性反应

Cotton is one of important economic crops. Verticillium wilt mainly caused by Verticillium dahliae massively damages the cotton production worldwide, leading to decrease of yield and quality of fiber. Many methods have been implemented to control V. dahliae damage, but the low efficiency is acquired. Thereby, Verticillium wilt is called as cotton “cancer”. Recently, molecular biotechnology is a powerful tool in plant breeding, especially resistance against insect and pathogens. It is a pivotal to isolate and address the function of the candidate genes regarding defense to biotic stresses in molecular breeding. We have cloned a pair of WRKY genes response to V. dahliae infection from Gossypium hirsutum, provisionally named as GhWRKY28 and GhWRKY28-like. Primary results showed that GhWRKY28 and GhWRKY28-like coordinately regulated the resistance of cotton plants against V. dahliae. Phosphorylation of the two proteins could modulate cotton defense to the fungi. In this project, we should employ “loss-” and “gain-of-function”, binding of protein and DNA cis-elements, protein phosphorylation, and so on for elucidating the GhWRKY28 and GhWRKY28-like defense function. Our goal should document that GhWRKY28 and GhWRKY28-like participate in plant innate immune response and involve in MAPK cascade and defense signaling pathways to protect cotton from V. dahliae.

棉花是重要的经济作物，大丽轮枝菌引起的黄萎病是影响纤维产量品质的主要因素之一。目前黄萎病防治措施效果不理想，对棉花危害日趋加重，因此该病被称为棉花的“癌症”。分子生物技术育种是解决棉花黄萎病危害最好方法之一，而分离和鉴定抗病候选基因是培育抗病品种的前提条件。我们从棉花中分离一对抗病相关的WRKY基因，暂命名为GhWRKY28和GhWRKY28-like。初步研究表明这对转录因子通过磷酸化反应调控棉花对大丽轮枝菌的抗性。本课题拟通过反向遗传学、植物病理学和植物化学等学科技术和方法，包括基因功能缺失和过量表达、蛋白与DNA顺式元件结合、磷酸化修饰等，阐明GhWRKY28和GhWRKY28-like翻译后磷酸化修饰对大丽轮枝菌抗性反应的调控功能。揭示这对WRKY转录因子对下游抗病基因转录活性调控的分子机制，解析它们在植物先天免疫反应中磷酸化级联信号传导和激素信号分子途径中的网络关系。

棉花是重要的经济作物，其纤维是纺织工业重要的原料，棉籽油和棉籽饼作为重要的食用油和蛋白饲料为人类利用，是国民经济发展的重要部分。然而棉花生产受到病虫害的严重危害，其中，棉花黄萎病是制约棉花生产的最主要因素之一。目前棉花黄萎病难以防治，其原因除了其病原菌大丽轮枝菌是一个土传性维管束寄生等复杂特征外，没有发现免疫性的抗病种质资源用于抗病育种也是一个主要原因。因此，挖掘棉花抗病相关基因并利用到抗病育种中是解决黄萎病危害的最好方法。本课题首先挖掘了棉花中抗病相关的WRKY转录因子家族基因，发现主要有8个抗病相关的WRKY转录因子，包括WRKY7、WRKY33、WRKY3、WRKY22(原名WRKY28)、WRKY48（WRKY28-like）、WRKY70、WRKY72和WRKY40。对WRKY22、WRKY48和WRKY33蛋白编码基因进行沉默表达分析，发现它们均参与棉花对大丽轮枝菌的抗性。其中WRKY22为正调控棉花抗病性，而WRKY48为负调控棉花抗性；WRKY22和WRKY48均涉及到JA激素的信号途径，参与下游PDF1.2和PDA3等基因的转录表达。进一步研究发现WRKY22和WRKY48这两个蛋白发生磷酸化修饰，而且WRKY22和WRKY48蛋白磷酸化受到大丽轮枝菌侵染诱导；这两个蛋白在磷酸化后稳定性表现差异，从而促进或抑制植株的抗病性。蛋白互作分析发现WRKY22和WRKY48能够与其它WRKY互作，其中与WRKY33互作能够直接影响植物的抗病性。在蛋白互作时发现GhWRKY48与一个泛素连接酶E3（GhWRF1）互作效应；揭示GhWRKY48能够被泛素化；泛素化和磷酸化是否存在共同调控棉花抗病性，需要进一步研究和探讨。本课题研究结果总体分析了棉花抗病相关WRKY转录因子家族的抗病性，也重点分析了WRKY22、WRKY48和WRKY33的抗病作用，并发现WRKY22和WRKY48磷酸化修饰作用，初步验证了它们磷酸化后的蛋白稳定性；同时发现WRKY48蛋白也存在泛素化，这可能说明WRKY蛋白存在复杂的蛋白翻译后修饰。这些研究结果不仅揭示了棉花WRKY转录因子抗病作用的层次性，丰富了植物抗病免疫反应理论，也为棉花抗病育种提供了候选基因。