梨亚油酸（亚麻酸）合成关键酶FAD调控果实香气形成的作用机制

Aroma is one of crucial factors for fruit quality. The aroma of most pear cultivars in China was light, which could not compete with European pear in the market, and required to carry out study on the theory and technology of improving the quality of pear fruit aroma. In our previous study, it was found that feeding exogenous linoleic acid and linoleic acid could effectively improve the flavor of pear fruit, however the effect of linoleic acid and linolenic acid on the formation and regulation of pear fruit aroma remains unclear at present. This study was based on the differentially expressed FAD genes and transcriptional factors obtained by RNA-seq. To clarify The mechanism of fruit aroma regulated by linoleic acid/linolenic acid synthetase FAD in pear, ‘Nanguoli’ （with rich aroma）and ‘Huangjinli’（aroma is weak）will be employed to explore the expression character of PuFAD genes by qRT-PCR and in vitro hybridization techniques. Cloning full length of PuFAD gene, sequence analysis of its promoter sequence, screening of upstream regulatory protein of PuFAD gene using yeast one hybrid technology and dual luciferase reporter system, sub-cellular localization and transgenic functional identification of the gene will be carried out. This study will not only enrich the metabolism theory of fruit aroma, but also provide fundament for regulation of aroma synthesis in future.

香气是重要的果实品质指标之一，但我国主栽梨品种香味较淡，无法与西洋梨竞争，提高果实香气是梨产业面临的重要问题之一。前期研究表明，外源饲喂亚油酸、亚麻酸可提高梨果实香气，但梨果实内源亚油酸、亚麻酸等香气代谢底物形成与调控的机制尚不清楚。该研究基于RNA-seq获得FAD差异表达基因及转录调控因子基础上，拟以香气浓郁的南果梨及香气较淡的黄金梨为试材，通过qRT-PCR 和组织原位杂交技术研究PuFAD基因的时空表达特征，克隆PuFAD基因全长和启动子序列并进行基因序列分析，利用酵母单杂交技术和双荧光素酶报告系统筛选PuFAD基因的上游调控蛋白基因，并进行基因的亚细胞定位和转基因功能验证，明确亚油酸（亚麻酸）合成关键酶FAD参与梨果实香气形成的作用机制。本研究将丰富果实香气代谢的生物学理论，为进一步进行果实香气的调控奠定基础。

中国梨产量和面积均居世界首位，但我国主栽梨品种香味较淡。阐明FAD在梨果实香气形成中的作用机制，不仅能丰富果实香气代谢的生物学理论，也可为生产中提高和改良果实香气提供参考。主要研究内容及结果概括如下：.(1)梨果实发育过程中果皮亚油酸、香气、酶活性、基因表达间的相关性分析. 从梨果实中共分离鉴定出挥发性芳香物质89种。‘南果梨’中与挥发性芳香物质呈极显著相关性的物质有棕榈烯酸、亚麻酸等。同时明确了差异基因与代谢底物关键酶间的相关性。.(2)PuFAD基因表达模式分析及基因全长克隆、亚细胞定位、功能鉴定. 研究了梨果实不同发育时期香气相关基因的表达变化，随着梨果实成熟度的提高，PbrFAD2及PbrFAD3基因相对表达量显著增加，而PbrLOX及PbrBHLH104的基因表达量显著下降，与转录组测序结果基本一致。. 克隆PuFAD3基因全长和启动子序列，对基因序列结构分析，Pbr033732.1与AtFAD3距离最近，命名为PbrFAD3。分析香气具有明显差异的南果梨和黄金梨果实FAD基因中氨基酸残基差异；PbrFAD3定位在细胞膜上；转化番茄进行功能鉴定，番茄果实形状略有改变，果实香气物质总量较对照提高43%，其中酯类物质较对照提高30.9%。梨果实 PuFAD8基因番茄Crispr-Cas9基因敲除突变体的构建，用构建好的CAS9-FAD8载体（番茄）进行组培侵染实验。. (3)梨果实PuFAD启动子结合蛋白的鉴定及功能分析. 双荧光素酶报告系统筛选PuFAD2基因的上游调控蛋白，筛选到相关的转录因子11个，其中MYB基因2个，ERF基因8个，乙烯敏感因子1个。进行FAD2基因酵母文库筛库，挑选1000-2000之间的互作片段，测序后，在NCBI上BLAST，获得13个互作基因，功能需进一步研究.（4)PuFAD2调控果实香气的代谢通路研究. 找到了脂肪酸合成途径中与不饱和脂肪酸合成相关的关键基因PuFAD2和PuFAD3。此外，酵母单杂交（Y1H）和双荧光素酶分析表明，PuERF008通过结合PuFAD2的启动子激活了PuFAD2的表达。