ADH基因调控梨果实酯类香气物质形成的机制研究

Aroma is an important quality character of fruit. Many oriental pear cultivars has little aroma than western pear, so researches on aroma synthesis and regulation mechanism of oriental pear have important practical significance. Esters are the predominant aroma of pear. Alcohol dehydrogenase(ADH) is one of key enzymes of esters synthesis. At present, the main study on ADH was its structure and catalytic activity, while the ADH gene and its functions were known little.The ADH gene participating to aroma ester synthesis of pear fruits were still unknown. In this research, P. ussariensis 'Nanguoli', a Chinese pear cultivar having a lot of aromatic was used as materials, the ADH gene participating to ester synthesis was selected and the enzymology character of ADH recombined protein was studied by bioinformatics, molecular biology, physiology, biochemistry and metabonomics technology. On the basis of the enzymology character of ADH recombined protein, ripe fruit was treated by exogenetic matter to study the expression characters of ADH gene in pear fruits at the level of RNA,protein,enzyme and metabolite, and its biology function in ester synthesis. According to these, the mechanism of ADH gene regulating aroma synthesis of pear fruits was defined. These results will not only enrich the metabolism theory of fruit aroma, but also provide fundament for regulation of aroma synthesis.

香气是果实品质的重要指标。与'西洋梨'相比，多数'东方梨'品种香味较淡,因此研究'东方梨'的香气形成与调控机制具有重要的现实意义。酯类是梨果实香气的重要组成，乙醇脱氢酶（ADH）是其代谢途径的关键酶之一。目前，对ADH的研究主要集中在酶的结构和催化活性上，而对其基因和相关功能的研究较少，参与梨果实酯类香气物质形成的ADH基因尚不清楚。本研究将以我国原产的香味较浓的'南果梨'果实为材料，采用生物信息学、分子生物学、植物生理生化和代谢组学相关技术，筛选出参与酯类香气物质形成的ADH基因，明确其重组蛋白的酶学特性；然后利用ADH重组蛋白的酶学特性，通过外源物质调控，明确ADH基因在梨果实RNA、蛋白、酶和代谢产物水平上的表达特性及酯类物质形成中的生物学功能，阐明ADH基因调控梨果实酯类香气物质形成的机制。研究结果不仅可丰富果实香气的代谢理论，也可为改善梨果实的香气品质奠定基础。

酯类是梨果实香气的重要组成，乙醇脱氢酶（ADH）是其代谢途径的关键酶之一。ADH是一种可催化醛醇间转化的氧化还原酶，然而有关梨的ADH及其编码基因的研究却鲜有报道。本研究利用同源比对从梨基因组中共鉴定出8个ADH基因，并对其结构与系统进化进行了分析。为筛选梨果实中参与酯类香气物质形成的候选基因，分别以酯类香气含量高的‘南果梨’和低的‘砀山酥梨’为材料，对其成熟过程中的ADH基因表达、ADH酶活性以及醇、醛、酯类都香气物质的含量进行了研究，结果表明酯类物质的形成与ADH6和ADH2的转录积累有关，ADH6可能是通过还原醛成对应的醇而参与酯类香气物质的形成，而ADH2可能以另外一种调控形式参与酯类香气物质的形成。.为进一步明确ADH2在梨果实酯类香气物质形成中的作用，我们构建了ADH2的表达载体并进行了原核表达，获得了ADH2的重组蛋白。对ADH2重组蛋白的酶学特性研究表明，ADH2重组蛋白是一种以氧化性为主的氧化还原酶，其催化反应的最佳结合因子为NAD+，外源K+、Ca2+均可促进其氧化性提高。在此基础上，我们开展了活体条件下钙对ADH2基因表达、酶活性以及相关代谢产物影响的研究。结果表明，在果实香气形成关键期外源喷施钙可激活果实内ADH2基因的表达，使ADH酶的活性显著升高，脂肪酸来源的酯类香气物质形成明显增加。.综上所述，ADH2和ADH6作为参与梨果实酯类香气物质形成的重要候选基因，ADH6可能是通过还原醛成对应的醇而参与酯类香气物质的形成，而ADH2则通过氧化醇形成对应的醛，并进一步氧化成酸而参与梨果实酯类香气物质的形成。这些结果基本阐明了ADH基因调控梨果实酯类香气物质形成的分子机理，为酯类代谢的进一步遗传改良提供了重要依据。