鸡NLRC5受体在宿主先天免疫功能调节中的作用机制及其验证

为探求解决当下养殖实际中鸡免疫功能低下和"药残"问题的新途径，本项目拟对鸡NLRC5受体在宿主先天免疫中调节功能以及作用机制进行研究，采用高/低抗性鸡品系（狼山鸡与安卡鸡）全同胞家系为素材，参照家禽先天免疫的发生和调控体系，应用分子克隆、Q-PCR分别检测正常和病原刺激条件下NLRC5受体及其上下游基因的时空表达差异与规律，根据免疫性状表达调控网络的"仿真"原则与通径理论，构建NLRC5受体的信号通路，提出禽类NLRC5受体参与免疫调控的生物学模型，并在细胞水平进一步验证；同时，在阐明NLRC5受体先天免疫信号通路的基础上，利用TOF质谱、单碱基突变技术对影响抗性的候选基因型、单倍型的遗传效应与生理、生化功能分别进行细胞水平和个体水平的鉴定、验证，为禽类的NLRC5受体分子功能及参与先天免疫调控的作用机制提供理论依据，也为抗性新品系的培育以及我国地方鸡优良种质特性的开发、利用提供技术支撑。

为探求解决当下养殖实际中鸡免疫功能低下和"药残"问题的新途径，本项目对鸡NLRC5受体在宿主先天免疫中功能以及作用机制进行研究，应用分子克隆、Q-PCR分别检测正常和病原刺激条件下NLRC5受体及其上下游基因的时空表达差异与规律，成功构建鸡了NLRC5受体参与先天免疫调控的信号通路；同时利用TOF质谱、单碱基突变技术筛选出抗性的候选基因型、单倍型，并探明其遗传效应与生理、生化功能，培育狼山鸡抗性新品系1个。发表论文21篇，SCI收录9篇，申请专利3项，培养博士1名, 硕士4名。主要结果如下： .（1）采用RT-PCR扩增狼山鸡脾脏组织NLRC5的CDS，并通过RACE法扩增3’UTR和5’UTR， 拼接成全长转录本，提交至GeneBank，获得登录号：JQ044414。.（2）利用Q-PCR检测经肠炎和白痢沙门氏菌刺激后的狼山鸡、罗斯鸡和广西黄鸡的肝、脾、盲肠等组织NLRC5受体表达水平，并进行表达谱分析，结合抗性指标和载菌量等表型指标，完成NLRC5受体参与鸡先天免疫的信号通路的构建。.（3）构建NLRC5过表达与ShRNA载体，转染DF1和HD11细胞系，利用Q-PCR检测上下游基因的表达量差异，验证已构建的NLRC5受体信号通路。.(4) 利用MALDI-TOF-MS技术检测对27个国内外鸡种NLRC5受体基因的SNP位点进行大规模筛选，发现37个SNP位点，我国地方鸡种SNP数普遍高于现代商品肉鸡。在狼山鸡NLRC5启动子区域de-1017、-2470处发现A/G单点突变，发现突变性启动子活性显著降低。双荧光素酶系统验证，A/G突变影响启动子活性，受反式作用元件NF-kB、STAT1的调控。.（5）根据基因型筛选AA、GG型狼山鸡半同胞个体各80只，经10 7CFU沙门氏菌刺激后发现，AA 型鸡各项抗性指标均优于GG。AA 型个体NLRC5低表达，而NF-κb信号通路基因高表达，表明NLRC5确实参与先天免疫且通过抑制NF-κb信号通路从而抑制炎症反应。.（6）利用荧光标记微卫星分型技术，通过MHC-Ⅰ（MCW0371）和MHC-Ⅳ（LEI0258）对狼山鸡进行血型判定，发现狼山鸡B21血型个体的免疫性状（H/L比值、IgM、IgG和IFN-γ含量）均优于其他血型。结合-2470处发现A/G突变，在狼山鸡群中进行继代选育，培育出1个高抗狼山鸡新品系。