骨桥蛋白OPN对肝再生中肝细胞增殖的作用研究

Osteopontin (OPN) could promote inflammation response, cell proliferation or migration, and then participate in the occurrence and progression of hepatitis, liver fibrosis or liver tumors. However, it is unclear whether OPN, as an acute phase protein and immunoregulatory cytokine, could promote the proliferation of liver cells during liver regeneration. Our previous experimental data showed that OPN could obviously increase liver regeneration level after rats 2/3 PHx. Hepatocyte is the most important kind of liver type mobilizated in liver regeneration, and activated hepatocytes also can express and secret OPN. However, present studies showed that only NKT cells, neutrophils and hepatic satellite cells, etc were OPN's target cells. Therefore, it is worth to study whether OPN can target and affect the proliferation and survival of hepatocytes, and then further influence liver regeneration. This study will investigate the effect of OPN on proliferation of primary cultured rat hepatocyte in vitro by increasing and decreasing exogenous OPN, up-regulating and down-regulating the expression of endogenous OPN, and then clarify the role of OPN in hepatocyte proliferation and liver regeneration in vivo by utilizing OPN-deficient mice. The purpose of this research is to study the regulatory effect of OPN on hepatocyte proliferation and its underlying mechanism, and then to provide the experimental basis for exploring OPN as a new safe drug to stimulate liver regeneration during the occurrence of liver diseases.

骨桥蛋白（OPN）通过促进炎症反应、细胞增殖或迁移而参与多种肝病的发生，但作为急性期蛋白、炎性细胞因子的OPN是否参与促进肝再生中的细胞增殖缺乏研究。前期工作发现OPN具有显著促肝再生作用。而肝细胞是部分肝切除（PHx）后动员的主要细胞，活化的肝细胞也能表达、分泌大量OPN，目前研究表明NKT细胞、中性粒细胞、肝星形细胞等是OPN的靶细胞。因此，肝细胞是不是OPN的靶细胞，OPN能否调控肝细胞的增殖和生存，进而调控肝再生值得深入研究。为此，本课题拟在体外考察增加和减少外源性OPN、上调和下调内源性OPN的表达对原代肝细胞增殖的影响，在体内以OPN-/-小鼠为对象从整体水平上研究OPN缺失对PHx后肝细胞增殖、肝再生的作用。本课题试图阐明OPN对再生肝中肝细胞增殖的调控机理，为寻找新的安全的刺激肝再生的治疗药物提供实验依据，为未来可能利用OPN提高肝病基础疾患下的肝再生能力奠定基础。

作为急性期蛋白、炎症反应调节因子的骨桥蛋白(OPN)除与肝脏疾病的发生关系密切外，可能也参与肝再生，促进受损肝脏细胞的自我修复。而肝细胞是肝再生中动员的主要细胞，因此OPN能否有效地作用于肝细胞，并影响肝再生尚不清楚。本项目首先借助大鼠Rat Genome 230 2.0 Array及IPA分析、预测了OPN信号通路在转录水平上对再生肝的调控，发现5条途径均被激活，但ERK1/2通路可能发挥较重要作用；进一步检测、分析发现细胞增殖、活化、炎症和趋化等活动在肝细胞、陷窝细胞、卵圆细胞和胆管上皮细胞中显著增强。体外以大鼠BRL-3A肝细胞为研究对象，通过慢病毒介导和siRNA方法改变内源性OPN的表达水平，发现OPN可通过ERK1/2，PI3K/AKT和JAK/STAT3通路调控靶蛋白CCND1，BCL2和BAX的表达而促进肝细胞增殖和生长。进一步以大鼠原代肝细胞为研究对象，以腺病毒介导的方法改变内源性OPN的表达水平，同样发现OPN对原代细胞增殖和活力具有明显的正调控作用。后又通过尾静脉注射方法将OPN表达质粒及其干扰质粒注入大鼠再生肝，发现内源性OPN能促进肝再生中的炎症反应和细胞增殖，却抑制细胞凋亡。此外，通过添加rOPN及中和性抗体检测外源性OPN含量变化对BRL-3A细胞的影响，结果与内源性改变OPN表达的效果较一致。接着通过尾静脉注射方法检测外源性OPN改变对大鼠肝再生的体内影响。上述结果充分证明OPN可以靶作用于肝细胞，促进肝细胞的增殖和活化，此结果有助于了解再生肝的细胞增殖调控机理，进而为提高肝脏疾病基础疾患下肝脏的再生能力提供理论基础，对治疗肝脏疾病药物的开发具有显著的理论意义和临床价值。