丝氨酸蛋白酶抑制剂Ⅲ对大鼠再生肝的肝细胞增殖调控机理研究

Our laboratory discovered SPINK3 gene is closely related with hepatocyte proliferation when we studied the regulation of hepatocyte proliferation during rat liver regeneration. However, the mechanism of its regulation remains unclear. Therefore, this item will further study the effect of SPINK3 on hepatocyte proliferation. Firstly, we treated liver cancer cells, isolated primary hepatocytes and regenerating liver with the methods such as gene addition, gene interference and antibody inhibition, and then detected the expressive changes of genes and proteins of SPINK3 and EGFR signaling-related genes using the method such as RT-PCR, Western Blot and so on. Meanwhile, we detected the reffects of SPINK3 on cell proliferation with growth curve, flow cytometry, etc. This study set a basis for us to understand the similarities and differences of regulation mechanism of hepatocyte proliferation between normal cells and tumor cells, in vivo and in vitro. The results obtained in the course of the study are expected to publish 2-3 papers in SCI Journals.

本实验室研究大鼠肝再生中肝细胞增殖调控发现，SPINK3与肝细胞增殖密切相关，然而其调控机制尚不清楚。为此，本项目拟进一步研究SPINK3调控肝细胞增殖的机理。首先用基因添加、干涉和抗体抑制等方法处理肝癌细胞、肝细胞及再生肝，然后用RT-PCR、Western Blot等方法检测上述材料的SPINK3及其受体EGFR和相应的信号通路相关基因和蛋白的变化，用生长曲线、流式细胞术等方法检测SPINK3对细胞增殖的影响，进而分析大鼠肝再生中SPINK3调控肝细胞增殖的机理，为了解正常细胞与肿瘤细胞、体内与体外的肝细胞增殖调控机理异同奠定基础。预期研究成果是发表SCI论文2-3篇。

研究表明，丝氨酸蛋白酶抑制剂Ⅲ（SPINK3）不仅是一种胰蛋白酶抑制剂，而且是一类结构与表皮生长因子(EGF)相似的生长因子，能够与EGFR结合进而促进细胞增殖。本实验室研究大鼠肝再生中肝细胞增殖调控发现，SPINK3与肝细胞增殖密切相关，然而其调控机制尚不清楚。为此，本项目拟进一步研究SPINK3调控肝细胞增殖的机理。本研究首先进行了高通量生物信息学分析，用大鼠全基因组芯片Rat Genome 230 2.0检测部分肝切除后再生肝的基因表达变化以及SPINK3/EGFR信号通路相关基因在大鼠再生肝肝细胞中的表达变化，发现spink3在PH后2-24h和72-168h表达显著上调，其促进细胞增殖的功能基本与大鼠肝再生进程相符。大鼠再生肝肝细胞中有28个基因发生有意义表达变化，25个上调，3个下调。分析信号通路发现，不同的途径调控不同肝脏细胞的增殖。然后用基因添加、干涉和重组蛋白等方法处理原代大鼠肝细胞及大鼠正常肝细胞BRL-3A细胞，用RT-PCR、Western Blot等方法检测上述材料的SPINK3及其受体EGFR和相应的信号通路相关基因和蛋白的变化，用CCK8、MTT、BrdU、流式细胞术等检测SPINK3对细胞增殖的影响。另外将含有SPINK3基因或有效shRNA片段的腺病毒载体、重组蛋白等通过尾静脉液压转基因方法注入大鼠再生肝内，检测肝再生率和肝增殖指数等情况。实验结果显示SPINK3表达上调时促进BRL-3A细胞和原代大鼠肝细胞的增殖，抑制细胞凋亡。SPINK3表达下调时则抑制肝细胞增殖，促进肝细胞凋亡。通过本研究发现在肝细胞中ERK1/2、JAK-STAT和PI3K-AKT三条通路起调控作用，这有助于了解SPINK3对肝细胞增殖调控的作用及途径，将为阐明正常细胞与肿瘤细胞、体内与体外的细胞增殖调控机理异同，为了解再生肝和肝脏疾病发生的机制、建立治疗和预防肝病方法、开发预防和治疗肝病药物、构建人工肝脏等研究奠定基础，具有重大的理论意义和临床应用价值。