Ubqln4通过磷酸化修饰调控p53通路抑制胃癌发生的机制研究

Ubqln4, also known as A1Up/CIP75/UBIN, is a non-proteasome ubiquitin binding protein that is involved in intracellular ubiquitin proteasome pathways and mediates the occurrence of spinocerebellar ataxia. There are no reports of Ubqln4 related to cancer yet. Our previous study had found that Ubqln4 protein was significantly differentially expressed in gastric cancer tissues and corresponding precancerous tissues. Moreover, we confirmed Ubqln4 phosphorylation and activation of p53 signaling pathway, but its specific regulatory mechanism is not clear. Based on these original works, this study intends to take Ubqln4 phosphorylated modification and its relationship with p53 signaling pathway as starting point, revealing that Ubqln4 inhibits the molecular mechanism of gastric carcinogenesis via phosphorylation of p53 pathway from the level of molecule-cell-omics. The aim of this study is to elucidate the role of Ubqln4 in the progression of gastric cancer and its regulation mechanism, and to provide a new idea for Ubqln4 clinical research and targeted therapy of gastric cancer.

Ubqln4，又名A1Up/CIP75/UBIN，是一类非蛋白酶体的泛素结合蛋白，参与细胞内泛素蛋白酶体途径并介导脊髓小脑共济失调症的发生。目前未见Ubqln4与癌症相关的报道。我们前期研究发现Ubqln4蛋白在胃癌的癌症组织和相应的癌旁组织中存在明显的差异表达，并且证实Ubqln4发生磷酸化修饰并激活p53信号通路，但具体调控机制并不明确。本课题拟在此基础上，以Ubqln4的磷酸化修饰及其与p53信号通路的关系为切入点，从分子-细胞-组学三个层次，揭示Ubqln4通过磷酸化修饰调控p53通路进而抑制胃癌发生的分子机制。旨在阐明Ubqln4在胃癌进程中的作用及其调控机理，并且为Ubqln4的临床医学研究和胃癌的靶向干预治疗提供新的思路。

我们通过生物信息学分析发现UBQLN4在多种人类肿瘤中呈现差异表达，并且出现拷贝数扩增。其在多种肿瘤组织中DNA扩增状态与mRNA水平的升高明显正相关，在不同肿瘤中具有不同的预后价值。此外，UBQLN4与多个细胞周期调控蛋白在多种肿瘤中呈现高度相关的表达模式。随后，我们利用细胞免疫荧光结合激光共聚焦观察到外源性UBQLN4的细胞定位存在周期相关性。细胞内外源UBQLN4蛋白在细胞定位不完全一致，内源UBQLN4以细胞核定位为主，而外源UBQLN4的细胞质定位信号明显增强。外源性UBQLN4和PLK1可以在有丝分裂中期共同定位于中心体位置，在有丝分裂末期，二者的共定位现象消失。.对UBQLN4进一步的研究证实，UBQLN4在有丝分裂期（M期）发生丝/苏氨酸位点磷酸化修饰的过程不具有肿瘤特异性。通过构建系列定点突变体，我们明确了UBQLN4在M期发生磷酸化的位点为其133-313氨基酸区域内12个丝氨酸和苏氨酸残基，CDK1/Cyclin B1复合体对UBQLN4 的磷酸化依赖于这些位点的存在。这些位点同时突变我们称之为UBQLN4磷酸化位点突变体，即PSM。通过Co-IP实验发现，UBQLN4与CDK1及PLK1的相互作用不完全依赖UBQLN4的磷酸化。我们利用细胞周期同步化将细胞阻滞在不同时相，发现UBQLN4磷酸化可抑制有丝分裂期PLK1蛋白的表达水平。蛋白半衰期及泛素化实验表明PSM抑制PLK1泛素化降解及泛素化水平。因此，UBQLN4在M期调控PLK1的泛素化降解需要依赖其磷酸化。此外，我们结合流式细胞术、激光共聚焦显微镜及实时动态活细胞监测系统观察UBQLN4及PSM细胞分裂及有丝分裂相的变化，可见UBQLN4磷酸化显著延长细胞有丝分裂时长，尤其有丝分裂中期时长。其磷酸化亦可导致细胞分裂时更少出现细胞核形态异常，且导致细胞异常有丝分裂相显著降低。同时，我们的部分研究也表明UBQLN4磷酸化也参与了肿瘤发生发展，内源性敲除UBQLN4后可能在不同细胞中激活不同的蛋白调控通路。.我们阐明了CDK1/Cyclin B1介导的UBQLN4磷酸化在有丝分裂期调控PLK1降解和有丝分裂进程的机制。我们最先证实UBQLN4磷酸化修饰可促进PLK1通过泛素-蛋白酶体途径降解，延长细胞有丝分裂时长及维持基因组稳定性。这些研究揭示了UBQLN4是调节细胞周期的关键因子。