广西普通野生稻苗期耐冷主效QTL qSCT-4-1的克隆及其分子机理的初步研究

Cold weather occurred in late spring or in autumn is a great threat to the rice production in central and southern China, resulting in heavy loss in yield and lowered quality.Thus cold damage is one of the most important limiting abiotic stresses in rice production.In our previous studies, we had fine mapped a major QTL, qSCT-4-1, which confers the cold-sensitive indica cultivar recurrent parent 9311 cold tolerance in seedling stage, to about 273-kb region flanked by markers L4009 and L4073 in the chromosome 4 of a chromosome segment substitution line (CSSL) DC1006 derived from Guangxi common wild rice DP15 as the cold tolerance donor parent in the genetic background of var. 9311. This proposal aims at cloning the cold tolerance gene on the locus of qSCT-4-1 by map-based cloning approach.In this proposal,qSCT-4-1 will be further fine-mapped to a more small region and finally be isolated by means of candidate genes'sequencing analysis or DC1006 genomic DNA library screening; and then the target gene of qSCT-4-1 will be confirmed by genetic complementation test.Furthermore,the cold-tolerant function of gene,qSCT-4-1, will be demonstrated by means of target gene overexpression and RNAi approach;Realtime PCR or Northern Blotting technologies will be employed to analyze the expression pattern of target gene; and at last unraveling the molecular mechanisms of qSCT-4-1 in mediating rice cold tolerance by means of bioinformatics, physiological,and biochemical technologies. Knowledge and novel gene gained from this study will facilitate future breeding of novel rice cultivars with improved cold tolerance.

冷胁迫是制约水稻生产的主要非生物胁迫之一。我国长江中下游及南方稻作区的水稻栽培常遭遇"倒春寒"或"寒露风"等异常气候因素引起的冷害严重影响水稻的产量与品质。在预研工作中，我们在广西普通野生稻DP15构建的染色体片段替换系DC1006（9311遗传背景）中发现一个苗期耐冷主效QTL qSCT-4-1，并已将其定位在273kb的范围内。本项目拟采用图位克隆方法将该QTL位点上的耐冷基因进行克隆。将对QTL进行高精度连锁分析；然后通过测序分析或筛选基因组文库以及互补表达实验分离QTL位点上的耐冷目的基因。通过基因的过量表达和RNA干扰实验验证其耐冷功能；通过Realtime PCR或Northern Blotting方法分析基因的表达模式；通过生物信息学和生理生化实验方法分析基因的功能及其所介导的生理生化代谢途径，揭示qSCT-4-1基因的耐冷调控分子机制，为耐冷水稻品种的培育提供有利基因资源。

本项目依照项目任务书，认真推动项目的实施。 在项目实施过程中，我们发现定位区域内预测的两个候选基因之一（LOC_os04g51180）为耐冷基因COLD1，该基因的研究于2015年2月发表于世界顶级学术刊物Cell上。于是我们决定调整研究任务，从广西普通野生稻DP15和9311构建的片段替换系群体中筛选其他耐冷的片段替换系。在耐冷表型筛选过程中我们找到了关键替换系DC90，在12号染色体上有一段来自于亲本DP15的替换片段，在耐冷表型鉴定中我们发现DC90耐受低温胁迫。结合耐冷表型及基因型进行遗传分析，我们发现 12号染色体上来自亲本DP15的替换片段是造成耐受冷胁迫的原因。这说明在该区域存在一个耐冷QTL位点。我们将该位点命名为qCTS12，随后我们立即展开qCTS12的精细定位工作。为了探究广西普通野生稻苗期耐冷分子机理，我们从转录组、蛋白质组和代谢组学等方面入手，关注DC90和9311在冷胁迫下差异表达的基因，蛋白及代谢物的谱系，深入揭示广西普通野生稻苗期耐冷可能的调控机理。. 比较转录组分析发现低温胁迫早期DC90和9311中共同鉴定到了2348个差异表达基因参与冷胁迫的应答。DC90中鉴定特异表达的基因有659个。根据基因的注释发现，大部分差异表达基因定位在在叶绿体中，表明水稻耐冷性和光合作用之间存在着紧密的联系。.比较蛋白组分析发现，冷胁迫和恢复阶段，在DC90中鉴定到155个差异表达蛋白，9311中鉴定到206个差异表达蛋白。这些差异表达蛋白一部分是“核糖体”和“发色团”的组分，另一部分参与“光合作用和光捕获”等过程。表达模式分析（STEM）发现9311和DC90之间核糖体和叶绿体蛋白质的存在不同胁迫响应模式。.胁迫生理分析表明，DC90中的qCTS12等位基因维持了过氧化氢酶（CAT）在胁迫阶段的组成型活性，确保其在冷胁迫阶段（冷驯化）和恢复阶段（去驯化）核糖体蛋白和叶绿体蛋白稳定的动态响应过程，因而，与9311相比呈现出了不同的胁迫响应模式，从而提高了水稻耐冷性。. 综上所述，我们认为叶绿体是水稻低温应答下游调控主要场所，大量差异表达基因和差异表达蛋白定位于叶绿体中。qCTS12通过维持了冷胁迫下过氧化氢清除和产生间的平衡保护胁迫阶段核糖体蛋白和叶绿体蛋白的动态响应，从而提高了水稻耐冷性。