基于籼稻染色体单片段替换系的苗期冷敏感主效QTL qCSS12 的克隆及其调控分子机理的初步研究

Low temperature occurred in late spring or in autumn is of great threat to the rice production in China, resulting in heavy yield loss and lowered rice quality. Therefore, cold damage is one of the most important limiting abiotic stresses in rice production. In our previous studies, we fine mapped a major QTL, qCSS12, which confers the cold-sensitive at seedling stage, to about 68-kb region flanked by molecular markers M14 and M15 on short arm of chromosome 12 by using a chromosome segment substitution line (CSSL). The CSSL derived from introgressed a cold sensitive indica rice, Nona Bokra, into cold tolerant japonica rice, Koshihikari by backcrossing. This proposal aims at cloning and functional dissection of the cold sensitive gene on the qCSS12 locus. Here, qCSS12 will be isolated by means of candidate genes' sequencing analysis or genomic DNA library screening, and then the target gene of qCSS12 will be determined by genetic complementation test. Furthermore, the cold sensitive phenotype mediated by qCSS12, will be demonstrated by overexpression, RNAi, and/or CRISPR/Cas9 gene editing of qCSS12. qPCR, Northern Blotting, or in situ hybridization technologies will be employed to analyze the expression pattern of target gene. At last, unraveling the molecular mechanisms of qCSS12 underlying rice cold response phenotype by means of bioinformatics, physiological, and biochemical technologies. Meanwhile, the relationship and roles of qCSS12 in the cold-resistance divergence between indica and japonica rice in the histories of rice domestication will be revealled by phylogenetic analysis of qCSS12. Knowledge and novel gene gained from this study will facilitate the breeding of novel rice cultivars with improved cold tolerance.

冷胁迫是制约水稻生产的主要非生物胁迫之一。我国栽培的水稻常遭遇“倒春寒”或“寒露风”等异常气候因素而造成冷害，严重影响水稻的产量与品质。在前期工作中，我们利用基于籼稻Nona Bokra为供体构建的染色体单片段替换系发现一个苗期冷敏感主效QTL qCSS12，并将其精细定位在68kb的范围内。本项目拟通过测序分析或筛选基因组文库分离该位点上的冷敏感基因；通过互补表达、过量表达、RNAi、以及CRISPR/Cas9基因编辑等方法验证基因的低温表型效应；通过qPCR等方法分析基因的表达模式；通过生物信息学和生化实验方法分析基因的功能及其所介导的生化代谢途径；通过分子进化研究方法揭示该基因与籼粳稻耐冷进化分歧的关系及其在该进化事件中的地位。通过本项目研究，可从水稻中克隆一个低温胁迫相关调控基因，揭示耐冷调控分子机制，为耐冷水稻品种的培育提供有利基因资源；同时初步揭示籼粳稻耐冷性进化分歧可能过程。

逆境胁迫主要是指农作物在栽培过程中时常遭受各种异常气候因素（如干旱、低温、高温等）以及病虫害的影响而造成伤害。其中，低温是严重影响农作物生长及产量的主要非生物胁迫之一。为了应对低温对水稻栽培的不利影响，定位克隆水稻耐冷性调控 QTLs/基因，了解耐冷调控的分子机制，是耐冷水稻品种培育的工作基础。. 本项目利用以染色体单片段替换系为材料，对冷敏感QTL qCSS12进行了定位克隆和功能研究，获得了如下成果：.1.克隆了一个可以育种应用的水稻耐冷基因CSS12。CSS12基因对水稻的产量相关性状不产生影响，而且将其导入籼稻品种中可提高籼稻的耐冷性，对解决水稻生产过程中频遭冷害的问题具有极大的应用前景，具有重大的社会意义和经济效益。.2. CSS12基因是一个R基因，编码与抗病虫相关的R蛋白。从目前的认知来看，大多数的研究报道均认为R蛋白与植物的生物胁迫抗性有关。而本研究发现CSS12基因是一个编码R蛋白的基因，并且该基因与水稻的耐冷相关，调控着植物的非生物胁迫抗性。因此，揭示CSS12基因对耐冷调控的分子机制具有重大的科学意义，有助于人们深入了解R基因的功能，增进人们的科学认识。 .3. CSS12基因可能是水稻耐冷性驯化的一个人工选择位点，与水稻的籼粳亚种分岐紧密相关。研究结果发现，大部分的粳稻品种具有耐冷性，而且与耐冷性等位基因CSS12连锁，而多数籼稻品种对低温敏感，其多数冷敏感表型与冷敏感等位基因css12连锁。同时，从CSS12全长基因组水平进行比较分析，发现粳稻亚种的CSS12比籼稻亚种的css12片段长，而籼稻亚种的css12等位基因与水稻近缘祖先种普通野生稻的序列片段同源性高。这一结果意味着，水稻籼粳亚种分化可能与水稻的耐冷性驯化存在着紧密关联，从耐冷表型演化的角度进一步支持了由野生稻演化成为水稻籼粳亚种的学说，对水稻演化的科学认识具有重要的意义。