微泡介导分泌型miR-9抑制鼻咽癌转移的机制研究

Recent studies show the importance of communication between tumor cells and their environment through shedding of membrane microvesicles, which can transport and exchange miRNAs among nonadjacent cells. Further studies identify secreted miRNAs as critical regulators in tumor angiogenesis. In our previous studies, we found that miR-9 was downregulated in nasopharyngeal carcinoma (NPC), and inhibited tumor growth and metastasis. Additionally, we overexpressed miR-9 in NPC cell lines, and established tumor-endothelial co-cultures, in which NPC and endothelial cells were separated by a transwell membrane insert. The results showed that NPC-secreted miR-9 suppressed endothelial cell migration. Therefore, we speculated that NPC-secreted miR-9 was packaged into microvesicle, then directly delivered to endothelial cells, and inhibited endothelial cell migration and tumor angiogenesis. To prove this hypothesis, we firstly will examine the effect of secreted miR-9 on NPC angiogenesis by in vivo and in vitro studies. Then we will prove that NPC-derived miR-9 are delivered into endothelial cells via microvesicles by differential centrifugation, density gradient centrifugation, real-time PCR and confocal microscopy. Finally, we will predict and confirm the target genes of miR-9 using bioinformatics analyses and dual luciferase reporter assay. This study will provide a better understanding of NPC metastasis.

近年来研究表明，微泡介导的分泌型miRNA的细胞间交换是细胞通讯的一种新途径，在肿瘤血管形成中扮演重要角色。在前期工作中，我们发现miR-9在鼻咽癌低表达，可抑制癌细胞的增殖和转移能力；并且将过表达miR-9的鼻咽癌细胞与人脐静脉内皮细胞进行共培养后，鼻咽癌分泌型miR-9能抑制内皮细胞的迁移。我们推测鼻咽癌细胞分泌miR-9，通过微泡运输进入内皮细胞抑制其迁移从而抑制血管形成和转移的发生。为证实这一假设，我们拟通过体内外实验检测鼻咽癌分泌型miR-9对血管形成的影响；通过差速离心、密度梯度离心、荧光定量PCR和共聚焦显微镜扫描示踪等，证实微泡运输分泌型miR-9进入内皮细胞；通过生物信息学预测、荧光素酶报告基因实验、信号通路检测等，对miR-9进行靶基因预测和验证，阐明分泌型miR-9抑制内皮细胞迁移的分子机制，为鼻咽癌转移发生机理提供新的理论依据。

近年来研究表明，微泡介导分泌型miRNA 的细胞间交换是细胞通讯的一种新途径，在肿瘤血管生成中扮演重要角色。在前期工作中，我们发现miR-9 在鼻咽癌低表达，可抑制癌细胞的增殖和转移能力，并且将过表达miR-9 的鼻咽癌细胞与内皮细胞共培养后，鼻咽癌分泌型miR-9 能抑制内皮细胞的迁移。据此，我们推测鼻咽癌细胞分泌miR-9，通过微泡运输进入内皮细胞抑制其迁移从而抑制鼻咽癌血管生成和转移。在本项目中，我们将通过体内外实验检测鼻咽癌分泌型miR-9 对血管生成的影响；通过密度梯度离心、荧光定量PCR 和共聚焦显微镜扫描示踪等，证实微泡运输分泌型miR-9 进入内皮细胞；通过生物信息学预测、荧光素酶报告基因实验、信号通路检测等，对miR-9 进行靶基因预测和验证，阐明分泌型miR-9 抑制内皮细胞迁移的分子机制，为鼻咽癌转移发生机理提供新的理论依据。该项目按照研究计划和研究进度，进展顺利，取得的主要成果包括：（1）在组织标本中，采用原位杂交和免疫组化证实miR-9和微血管密度（CD31）的表达呈负相关，即miR-9表达较高的鼻咽癌组织中微血管密度越低。（2）在细胞实验中，我们采用密度梯度离心法，从鼻咽癌细胞5-8F和CNE1以及对照永生化鼻咽上皮细胞NP69上清液中提取exosome，通过扫描电镜、CD63标志物等方法定性定量，并从exosome中抽提miRNA检测miR-9表达，发现miR-9在鼻咽癌细胞exosome中表达低于对照组。遂采用慢病毒转染建立稳定过表达miR-9的鼻咽癌细胞株，收集上清抽提exosome，将exosome与内皮细胞共培养，激光共聚焦显微镜扫描示踪，鼻咽癌细胞分泌exosome携带miR-9进入内皮细胞，功能学实验结果表明，过表达miR-9可抑制内皮细胞增殖、迁移和成管能力。进一步通过生物信息学预测和双荧光素酶报告基因证实，MDK为miR-9靶基因，且miR-9的抗血管生成能力通过MDK实现。采用蛋白芯片进一步证实miR-9调控靶基因MDK可影响下游PDK1/AKT 信号通路。（3）动物实验进一步证实过表达miR-9可抑制癌细胞的血管生成能力。该项目的顺利完成，将为鼻咽癌转移发生机理提供新的理论依据，为鼻咽癌抗血管治疗提供新的分子靶点。