基于花生四烯酸CYP代谢通路的玉米源抗氧化肽调节细胞膜磷脂重构作用机制

Membrane phospholipid remodeling is important to the protection of cell membrane of antioxidant peptides. Our previous study indicated that the protection of cell membrane of corn-derived antioxidant peptides might be associated with their inhibitory activity on soluble epoxide hydrolase (sEH), a product of arachidonic acid CYP metabolism. This project aims to study the sEH-inhibitory activities and structure-activity relationships of corn-derived antioxidant peptides. Molecular docking will be used to figure out the action mechanism of sEH-inhibitory activities of corn-derived antioxidant peptides. With the usage of sEH inhibitors and siRNA, the regulation of corn-derived antioxidant peptides on arachidonic acid CYP metabolism will be confirmed. The effects of corn-derived antioxidant peptides on cellular epoxyeicosatrienoic acids (EET, a product of arachidonic acid CYP metabolism) and EET- phospholipid in cell membrane will be determined using HPLC-MS/MS to verify the role of arachidonic acid CYP in the regulation of cell membrane phospholipid remodeling by corn-derived antioxidant peptides. Finally, the relationships between the sEH-inhibitory activity corn-derived antioxidant peptides and intracellular EET and cell membrane EET-phospholipids will be analyzed to elucidate the exact regulation mechanisms of corn-derived antioxidant peptides on cell membrane phospholipid remodeling via arachidonic acid CYP metabolism. This work will provide evidence for the protection of cell membrane by corn-derived antioxidant peptides.

细胞膜磷脂重构对抗氧化肽的细胞膜保护具有重要意义。申请人前期研究发现玉米源抗氧化肽的细胞膜保护作用可能与其对花生四烯酸CYP代谢通路中可溶性环氧化物水解酶sEH的抑制作用有关。本项目拟研究玉米源抗氧化肽的sEH抑制活性及其构效关系，通过分子对接方法揭示玉米源抗氧化肽的sEH抑制活性机理；利用sEH抑制剂和siRNA技术，明确玉米源抗氧化肽sEH抑制活性对花生四烯酸CYP代谢通路的调节作用；利用串联质谱技术研究玉米源抗氧化肽对花生四烯酸CYP代谢产物环氧二十碳三烯酸（EET）与细胞膜EET-磷脂组成的影响，明确花生四烯酸CYP代谢通路在玉米源抗氧化肽调节细胞膜磷脂重构中的作用；统计分析玉米源抗氧化肽sEH抑制活性与细胞内EET含量以及细胞膜EET-磷脂组成之间的关系，阐明玉米源抗氧化肽基于花生四烯酸CYP代谢通路的细胞膜磷脂重构调节作用机制。本项目将为玉米源抗氧化肽的细胞膜保护作用提供依据。

可溶性环氧化物水解酶（soluble epoxide hydrolase，sEH）特异性水解花生四烯酸CYP代谢产物环氧二十碳三烯酸（epoxyeicosatrienoic acids，EET），使其失去生物活性。本项目构建了一种基于分子对接的sEH抑制肽快速筛选方法，从8400条二肽和三肽库中筛选得到5条sEH抑制肽WEY、WYW、YFW、WWY和YFY，其IC50值为55.41±1.55 μM~96.00±7.5 μM。米氏方程及Lineweaver-Burk双倒数曲线结果显示，以上5条sEH抑制肽均表现为竞争性和非竞争性混合抑制剂。分子间相互作用分析显示sEH抑制肽可与sEH活性中心Asp333等氨基酸残基之间形成包括氢键和π堆积在内的多种相互作用。利用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶制备的玉米肽均显示出良好的sEH抑制活性，IC50值为1.07±0.08 mg/mL~2.94±0.26 mg/mL，其中，碱性蛋白酶制备的玉米肽sEH抑制活性最强，并且能够显著抑制小鼠肝脏组织中sEH活性。利用nano LC-MS/MS，从碱性蛋白酶制备的玉米肽组分中成功鉴定出了WYW、YFW和YFY等3条sEH抑制肽序列。另外，不同蛋白酶制备的玉米肽对均具有较好的脂质过氧化抑制作用，其中，风味蛋白酶制备的玉米肽亚油酸过氧化抑制作用最强，碱性蛋白酶制备的玉米肽卵黄脂质过氧化抑制作用最强，中性蛋白酶制备的玉米肽肝脏脂质过氧化抑制作用最强。通过本项目研究，表征了玉米肽的sEH抑制活性，并揭示了其sEH抑制作用机制，明确了玉米肽的脂质过氧化抑制作用，为玉米源活性肽的细胞膜保护作用了理论依据。