脑红蛋白偶联能量代谢与EGFR/PTEN/AKT/PD-L1 调控胶质母细胞瘤免疫细胞浸润的作用

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common malignant brain tumor in adults. Abnormal energy metaboliam such as ischemia could promote GBM progession; however, the underlying mechanisms remain far from clear. Neuroglobin is a brain-specific oxygen-binding protein and is heavily associated with hypoxic or ischemic pathological processes. Immune cell infiltration is the basis of tumor immune therapy and is controlled by the PD-1/PD-L1 immune check-point axis signal. Blocking the PD-1/PD-L1 signal is the curent emphasis of cancer therapy. We have reported an anticancer effect of neuroglobini in hepatocellular carcinoma cells. Prelimary results showed that neuroglobin bound with EGFR, down-regulated PD-L1 and promoted immune cell infiltration, suggesting that neuroglobin might control GBM immune cell infiltration and progression via coupling energy metabolism with EGFR/PTEN/AKT/PD-L1. The aims of this project are to: 1) confirm the “Energy metabolism-neuroglobin-EGFR/PTEN/AKT/PD-L1” pathway; 2) verify the role of this pathway in immune cell infiltration of GBM; 3) explore the effects of neuroglobin alone or together with PD-1 antibody in GBM treatment in the animal model. The results might provide ground for GBM immune treatment.

胶质母细胞瘤(GBM)是成人最多见的脑恶性肿瘤。能量代谢障碍如缺血缺氧可促进GBM进展，但其机制还远不清楚。脑红蛋白是脑内特异的携氧蛋白，与脑缺血缺氧病理过程密切相关。免疫细胞浸润是肿瘤免疫治疗的基础，受PD-1/PD-L1免疫抑制检查点轴信号调控。阻断PD-1/PD-L1信号已成为当前肿瘤治疗的热点。我们已报道脑红蛋白在肝癌细胞中的抑癌作用。预实验发现脑红蛋白结合EGFR、下调PD-L1表达、促进GBM淋巴细胞浸润，提示脑红蛋白通过偶联能量代谢与EGFR/PTEN/AKT/PD-L1调控GBM免疫细胞浸润和发展。本项目拟：1)在GBM细胞确证“能量代谢-脑红蛋白-EGFR/PTEN/AKT/PD-L1”这一信号通路；2)明确这一信号通路调控GBM免疫细胞浸润的作用；3)动物模型中探讨脑红蛋白单独或联合PD-1抗体对GBM的治疗作用。研究结果将为GBM的免疫治疗提供理论依据或新思路。

胶质母细胞瘤高度恶性且对常规放化疗和免疫疗法抵抗。缺血缺氧是肿瘤组织能量代谢障碍的主要原因，贯穿于胶质瘤整个发生发展过程，且与耐药密切相关。本项目主要研究脑内特异的携氧脑红蛋白（Ngb）在胶质瘤发生发展中的作用及其治疗潜在价值。.本项目通过对胶质瘤数据库进行生物信息学分析，确认Ngb表达水平与胶质瘤级别、患者生存时间负相关；免疫组化结果证实Ngb低表达于高级别胶质瘤。在高侵袭性三阴型胶质母细胞瘤（G422TN）原位小鼠模型中内源性敲降、过表达脑红蛋白，观察到肿瘤细胞中Ngb的缺失显著降低了荷瘤小鼠的中位生存期。在Ngb敲除（Ngb+/-）小鼠中，验证了微环境中的Ngb表达降低并不会影响荷瘤小鼠的中位生存期。通过RNA测序，找到了敲除G422TN细胞中的Ngb后，主要改变了HIF-1和免疫信号传导，并通过生物信息学分析验证胶质瘤患者中Ngb mRNA水平与HIF-1α和免疫细胞浸润的相关性。在小鼠原位GL261胶质瘤模型中观察到过表达Ngb能显著增加CD3+、CD4+、CD8+T细胞的浸润。Western blot结果证明，Ngb在体外缺氧（主要受其氧结合位点H64影响）或体内T细胞浸润增强时对HIF-1α/PD-L1含量产生负调控。在肿瘤发展较早阶段通过腹腔内注射TAT-Ngb能显著改善荷瘤小鼠的存活。TAT-Ngb联合PD-1抗体、替莫唑胺同步放化疗在G422TN荷瘤小鼠中获得治愈效果，再挑战50％小鼠仍可再次获得长期存活，而所有其他联合疗法并未获得长期存活。.研究结果证实Ngb在GBM的发生发展过程、调控PD-L1 表达、调节免疫细胞浸润发挥了重要的作用，验证了GBM 存在“能量代谢-脑红蛋白-PD-L1-免疫细胞浸润”信号通路，确定了TAT-Ngb联合抗PD-1抗体和放化疗治疗高侵袭性胶质瘤的作用。综上所述，结合难治性GBM的免疫化学疗法，Ngb可能是可靠的抗肿瘤药物增效剂，这不仅为低氧靶向治疗提供了新的支持，确证“能量代谢-脑红蛋白-PD-L1-免疫细胞浸润”这一信号通路及其调控免疫细胞浸润的作用又为GBM 的免疫治疗提供新的理论依据或新思路。