桑雌蕊高表达特异蛋白及启动子的分离与功能分析

以果桑品种"大10"雌蕊为研究对象，以桑椹和叶片为对照材料，采用优化的IPG-IEF/ SDS-PAGE双向电泳技术，获得不同组织器官的蛋白质双向电泳图谱；应用ImageMaster 2D 图谱分析软件，分析在雌蕊花柱-柱头中高表达的特异蛋白斑点，并采用胶内酶切-生物质谱、N-末端测序及生物信息学等实验技术进行鉴定，获得在桑花柱-柱头中高丰度表达的特异蛋白；根据特异蛋白种类与氨基酸序列的分析，采用RT-PCR、TAIL-PCR等技术克隆其编码基因及启动子，分析并获得具有完整结构的启动子序列；构建含特异性启动子的融合基因及植物表达载体，采用基因枪转化法转化离体桑雌花穗，检测报告基因在雌花器官中的瞬时表达活性；可望获得在桑雌蕊中高丰度表达的特征蛋白5-10个、相关基因5个以上、强启动子2-3个及其转基因表达载体，研究成果将为果桑抗病转基因育种等应用研究提供理论依据及工作基础。

本项目主要以果桑品种“大10”为研究对象，应用蛋白质组学、分子生物学及生物信息学等技术，对桑树不同类型雌花与桑椹的蛋白质表达特征、差异蛋白鉴定及功能基因结构等进行了较为系统研究，获得了若干原创性研究成果。. 首先构建了桑雌花、果实蛋白质组学的实验技术体系。针对桑树葇荑花序及雌花器官的结构特征，独创了“液氮冻融切割法”处理雌花子房和花柱-柱头，保证了蛋白质样品的精确性和稳定性；优化了桑雌花及桑椹蛋白质样品制备技术，获得了一系列斑点清晰、重复稳定的双向电泳图谱，为构建桑树花器官蛋白质2-DE数据库奠定了基础。. 系列研究表明，桑雌花蛋白质组分及表达量受多种因素的影响而发生变化。从始花期、盛花期和末花期中分别检测到450±15、471±4和446±14个蛋白斑点，鉴定的25个差异表达蛋白分别涉及植物的基因转录和翻译、细胞代谢、氧化还原、细胞构成、应答防御等生命过程；其次，从雌花子房和花柱中分别检测到382±16和348±14个蛋白斑点，在28个分离良好的差异蛋白中，22个为花柱特异表达，鉴定的26个蛋白主要涉及胁迫应答反应、次生代谢、氧化还原反应以及蛋白质代谢等；此外，应用1-DE/MS的shotgun技术，成功鉴定了14种雌花发育相关蛋白组分。. 为使实验结果更具适用性，在原计划基础上增加了果桑新品种“SG01”用于对比试验，结果在桑品种“大10”与“SG01”之间，从雌花蛋白质表达谱中检测到了75个差异表达的斑点；从桑椹蛋白质表达谱中检测到了20个高表达的差异蛋白质，其中19个在“SG01”桑椹中特异表达；鉴定的差异表达蛋白质组分主要参与了植物逆境应答反应及蛋白质代谢等。. 根据差异蛋白质组的研究结果，克隆了桑雌花生长发育相关的重要功能基因序列8条，分别涉及逆境胁迫应答、花色素合成、桑椹成熟及病原菌侵染等生理过程。. 研究还发现，在桑树雌花中检测到胁迫应答相关蛋白的大量表达；桑品种间的蛋白质表达谱具有显著差异；多种高丰度蛋白的质谱鉴定却未能获得应有的结果；高丰度表达蛋白与转录水平是否具有相关性等问题，这些都为桑树生殖生物学的深入研究提供了新的课题。. 综上所述，本项目在桑树雌花发育、果实成熟及其调控分子机理方面获得了许多新的发现，丰富了桑树生殖生物学理论，也为果桑育种与栽培技术的应用研究提供了新的理论依据。