柑橘果实成熟特异启动子的分离与功能分析

果实特异启动子可以调控外源基因在果实中的定向高效表达，避免表达产物在其他组织器官中的无效积累，减少对植物的负面影响。因此，果实特异启动子的分离对于利用基因工程进行果实性状遗传改良具有重要的理论意义和应用价值。目前，尚未见柑橘果实特异启动子分离与鉴定的报道。本项目拟根据前期已获得的一个脐橙果实成熟特异基因（CsInvI/PMEI）序列，利用Genome Walking技术分离获得启动子序列，通过生物信息学分析其调控功能元件，应用瞬时表达和番茄转基因技术验证启动子的果实特异性调控功能，同时利用EMSA技术精确定位与转录因子结合的启动子特异功能调控元件，并应用金柑遗传转化体系研究CsInvI/PMEI启动子调控柑橘糖代谢关键酶基因在金柑果实中的特异表达，拟获得高糖金柑果实，为今后利用柑橘果实特异启动子CsInvI/PMEI进行果实品质改良的基因工程提供依据。

果实特异启动子可以调控外源基因在果实中的高效表达，避免外源基因表达产物在植物其他组织器官中的无效积累，减少对植物的负面影响。因此，果实特异启动子的分离对于利用基因工程进行果实性状遗传改良具有重要的理论意义和应用价值。目前，尚未见柑橘果实特异启动子分离与鉴定的报道。本项目根据前期已获得的一个脐橙果实成熟特异基因（CsPMEI）序列，利用Genome Walking技术分离获得启动子序列，全长1137bp；通过生物信息学软件分析，预测启动子的转录起始位点在-38bp处；同时发现该序列具有启动子的基本转录元件，不仅含有TATA-box 和CAAT-box 等真核生物典型的核心启动子区域，且包含G-box、CGTCA-motif、AC-I、ARE、CATT-motif、GATA-motif、GC-motif、GA-motif等34种调控元件；综合分析，该5’上游序列具有启动子特征元件，为柑橘果实特异基因CsPMEI的启动子区域；根据启动子序列分析结果，构建了3个包含不同功能区域启动子（-1~1137，-334~-1137，-1~-333）表达载体；应用瞬时表达分析，包含不同功能区域的启动子调控目的基因表达水平，发现目标启动子能驱动GUS基因在番茄和脐橙果实中表达，而其他组织器官表达较弱；进一步应用番茄转基因技术验证启动子的果实特异性调控功能，结果表明CsPMEI启动子具有果实特异性；同时，进一步将目标启动子CsPMEI驱动GUS基因导入金柑，分析其在柑橘中的表达调控，目前已获得一些抗性芽；构建了CsPMEI启动子驱动柑橘蔗糖磷酸合成酶基因（sucrose phosphate synthase， SPS）表达载体转化金柑，获得了若干抗性芽，为今后利用柑橘果实特异启动子CsPMEI进行果实品质改良的基因工程提供参考。本研究还增加了CsPMEI基因的功能分析，利用RACE技术分离获得了CsPMEI cDNA全长GenBank登录号：KC198084；生物信息学分析表明，该基因包含618bp完整的开放阅读框，编码205个氨基酸，属于InvI/PMEI家族成员；利用原核表达分析表明CsPMEI蛋白为果胶甲酯酶抑制子；应用拟南芥转基因分析进一步验证了CsPMEI为果胶甲酯酶抑制子；同时，也将CsPMEI导入金柑中进行过量表达，为分析该基因在果实成熟中的调控作用提供依据。