调节HIF-2α平衡自噬与凋亡增强低氧环境下软骨细胞自身保护的机制研究

组织工程可体外构建与关节软骨结构接近的三维软骨组织，给软骨损伤的修复带来希望，但核心区细胞生长状态欠佳导致三维软骨厚度不足仍是目前亟待解决的问题。本课题组首次发现此现象由低氧状态下核心区软骨细胞自噬被抑制引起，进一步研究证实低氧核心区的HIF-2α高表达可能是软骨细胞自噬被抑制的主要原因。但完全沉默HIF-2α并没有使核心区软骨细胞生长状态好转，蛋白电泳分析结果发现沉默HIF-2α不仅引起软骨细胞自噬，同时促进了其凋亡。而HIF-2α通过调节ROS控制PTP的开/关状态来平衡细胞自噬与凋亡。本研究拟以此为切入点，通过RNAi、基因转染等分子生物学手段深入探讨低氧环境下上述通路在软骨细胞自身保护中的作用；力图通过适量表达HIF-2α，在促进软骨细胞自噬的同时不增加其凋亡，改善三维软骨的构建，为临床治疗软骨损伤提供新的思路和手段。

本研究围绕种子细胞、低氧、细胞自噬以及移植等方面展开研究。发现软骨细胞的问题后及时更换了滑膜间充质干细胞为种子细胞并进行了深入研究。我们发现单纯低氧可以促进间充质干细胞增殖，低氧可以刺激HIF-1α-VEGF信号通路激活，单纯低氧可以促进Notch通路上下游的蛋白表达上调。结合临床明确了同种异体组织移植后关节液和外周血中Treg与Th17表达变化规律，为软骨移植的深入研究提供方法，为其迈向临床提供参考。进而明确了特定炎症环境下MSCs成软骨以及免疫调节能力的变化；发现AS的发生可能与MAPK和 TLR通路的激活有关，提示在特定的炎症环境下，MSCs的免疫调节发生异常；因此我们进一步对RA患者以及健康人（HD）的SMSC进行了表型鉴定和分化能力的对比，结果发现RA及HD的SMSC均具有成脂、成骨、成软骨能力，二者间没有明显区别，RA与HD的SMSC具有类似的免疫调节能力，但是当加入炎性因子IL-17A、TNF-α之后，其免疫能力受到明显抑制。以上结果表明： SMSCs具备分化软骨细胞的能力，同时具备免疫抑制潜能，作为组织工程良好的种子细胞应用前景广阔。.在上述研究的基础上，我们也对炎性环境下SMSCs免疫调节能力受抑制的机制进行了深入的研究，发现SMSCs 的在模拟炎症培养条件下自噬被明显诱导，而加入IL-17A 后，自噬则被抑制，提示自噬是IL-17A 引起SMSCs 免疫调节异常的关键作用位点。抑制自噬可促进对移植物排斥反应的机理不清。因此，我们进一步研究发现IL-17对pAkt 和p-mTOR 蛋白表达无影响，但可显著上调Bcl-2 的蛋白表达，却不影响Bcl-2 mRNA 表达，利用蛋白合成抑制剂干扰翻译过程，发现IL-17A可以显著地延缓SMSCs Bcl-2 的降解，表明IL-17A 通过抑制Bcl-2的降解促进其蛋白表达。因此，我们推断：IL-17 可通过抑制SMSCs Bcl-2 的降解促进其蛋白表达，增加Bcl-2 与Beclin-1 结合，影响Beclin1/Vps34/III型PI3K 复合物的形成，进而抑制自噬的启动，影响SMSCs 的免疫抑制功能。以此为切入点申请并获得了国家自然科学基金面上项目的资助。本研究在组织工程种子细胞、低氧、细胞自噬以及移植等方面均取得了一定的成果，完成了本课题的计划和任务，同时为后续相关研究奠定了坚实的基础。