circRNA介导PPARGC1A/NRF1/TFAM通路调控山羊卵泡闭锁分子机制的研究

Circular RNA (circRNA) could serve as a sponge for miRNA and RNA binding protein, and act as a transcriptional regulator in the development of reproductive system. Our previous study reported that miR-1197-3p suppressed target PPARGC1A expression to regulate mitochondrial functions and granulosa cells (GCs) apoptosis through PPARGC1A/NRF1/TFAM pathway, while the initiation mechanisms remain to be elucidated. In this study, we will investigate the regulations of PPARGC1A/NRF1/TFAM pathway in GCs functions during goat follicle atresia, and screen PPARGC1A or miR-1197-3p related circRNAs by high-throughput sequencing and further bioinformatics analysis. To further clarify the regulation of circRNAs as miR-1197-3p sponge or as a transcriptional regulator of PPARGC1A in GCs apoptosis, the circRNAs-PPARGC1A regulatory network will be detected using FISH, RNA/DNA pull down, and the gain or loss functions of the miR-1197-3p and circRNAs. This study will supply scientific evidence for the utilization of ovarian genetic resources and provide new insight for the therapy of ovarian lesions caused by aberrant functions of GCs.

环状RNA（circRNA）可直接或作为miRNA的“海绵”调节靶基因调控生殖生理过程。miR-1197-3p靶向PPARGC1A基因，可能通过PPARGC1A/NRF1/TFAM通路调节线粒体功能，进而调控颗粒细胞（Granulosa cells, GCs）凋亡，但作用机制仍不明确。因此，本项目以山羊卵巢为研究对象，继续探讨PPARGC1A/NRF1/TFAM通路在GCs凋亡中的作用，利用测序和生物信息学分析筛选卵泡闭锁过程中差异表达的circRNA，构建circRNA-miR-1197-3p互作网络，结合FISH、RNA/DNA pull down、过表达和干扰等方法筛选与miR-1197-3p具有ceRNA作用或直接调节PPARGC1A基因表达而参与调控GCs凋亡的circRNA，并阐明其作用机制，为开发利用卵巢遗传资源、GCs功能异常引起卵巢相关疾病的预防、诊断和治疗提供新的策略。

PPARGC1A/NRF1/TFAM通路在线粒体功能调节和细胞凋亡调控中有重要作用，然而其参与卵泡发育和闭锁的机理还不清楚。基于此，本研究主要开展了以下研究：. 在NMS及其受体基因克隆和序列结构分析的基础上，检测发现NMS及其受体在卵巢GCs中高表达。体外培养GCs发现，10-12M NMS能促进GCs分泌雌激素，但主要是通过与受体NMUR2结合发挥作用。NMS与NMUR2结合后会抑制hippo-yap通路核心蛋白在胞质中发生磷酸化，入核的YAP1与PPARGC1A互作并激活PPARGC1A/NRF1/TFM通路，促进线粒体发生融合，上调类固醇合成相关蛋白的表达，加速胆固醇进入线粒体。然而NMUR2、YAP1或PPARGC1A基因的干扰，会抑制GCs的分泌功能，扰乱卵泡微环境，促进颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁。. 过表达、干扰及回复试验发现，PPARGC1A/NRF1/TFAM通路在调节GCs 增殖、凋亡、类固醇激素合成及线粒体功能等方面有重要作用。在此基础上，利用生物信息学分析，双荧光素报告载体及FISH等方法，筛选并验证发现miR-1197-3p靶向PPARGC1A基因参与GCs凋亡及功能调节。在体外构建的GCs凋亡模型中也发现，添加miR-1197-3p inhibitor能上调PPARGC1A的表达而减缓GCs的凋亡。通过测序数据联合分析和系列功能验证试验，发现chi_circ_000467和LncRNA LOC102176306分别能与miR-1197-3p通过ceRNA机制调节靶基因PPARGC1A的表达，进而调控GCs 的凋亡和功能。. 在体外培养的GCs中，SNP（NO供体）能促进GCs中cGMP的表达，激活PPARGC1A/NRF1/TFAM通路的表达，通过调节线粒体的结构和功能而促进类固醇激素的合成。Arg作为NO合成的前体物质，在动物饲喂过程中，与能量不足动物相比，Arg补饲可提高能量利用率，抑制YAP1在胞质内磷酸化降解，入核的YAP1激活PPARGC1A/NRF1/TFAM通路，促进GCs增殖和分泌类固醇激素，进而调节卵泡的发育。. 本研究不仅丰富了肉羊生殖生理学研究，为肉羊的科学养殖提供理论基础，也为卵巢疾病的发生机理和治疗提供新的思路。