酿酒酵母内源性蔗糖转化酶SUC2的高效表达调控机制研究

Inulin is the second largest conserved polysaccharide in plants, and is a good substrate for alcohol production. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae is a suitable and widely used industrial microorganism for large-scale alcohol fermentations. Invertase SUC2 was identified as the key enzyme for inulin catabolism in S. cerevisiae. Although SUC2 is a constructive genomic component, the SUC2 activity varies greatly in different S. cerevisiae strains and the molecular mechanism causing such variation remained obscure. The aim of this project is to investigate the efficient expression regulation of SUC2 in S. cerevisiae strain L610 at the level of transcription and glycosylation, respectively. Firstly, we will identify the mutational evolution sites of SUC2 promoter and investigate its interaction with trans-acting factors MSN/Sko1. Secondly, we will use LC/MS and site directed mutagenesis to detect the key mannose transferases which cause the heterogeneity of glycosylation of SUC2. Finally, a recombinant S. cerevisiae strain with high ability of inulin hydrolysis and alcohol production will be constructed based on the above. Our work will elucidate the mechanism of efficient expression regulation of SUC2 in S. cerevisiae and lay the foundation for the industrial process of alcohol fermentation from inulin.

菊糖可替代淀粉作为酒精工业化发酵生产的优良基质。酿酒酵母代谢菊糖的关键酶是蔗糖转化酶SUC2，该酶的编码基因普遍存在于酿酒酵母染色体上，但不同酿酒酵母菌株水解菊糖的能力差异巨大，而导致这一差异的分子机制尚不清晰，阻碍了对酿酒酵母进行理性改造以实现高效转化菊糖生产酒精的工业化进程。本项目拟以菊糖利用型酿酒酵母L610对SUC2的表达调控为研究核心，分别通过探讨SUC2基因启动子的突变进化位点及其与反式作用因子的相互作用，以及研究甘露糖基转移酶与SUC2糖基化修饰不均一性的关联性，从转录调控和糖基化修饰调控水平上解析影响酿酒酵母菊糖水解能力的关键因素。在上述研究基础上对酿酒酵母进行综合改造，调控SUC2的转录和糖基化修饰，构建高效水解菊糖产酒精的酿酒酵母重组菌株。本项目研究将进一步阐明造成不同酿酒酵母菊糖水解能力差异性的分子机制，具有重要的理论研究意义和良好的应用前景。

酿酒酵母代谢菊糖的关键酶是蔗糖转化酶SUC2，该酶的编码基因普遍存在于酿酒酵母染色体上，但不同酿酒酵母菌株水解菊糖的能力差异巨大，而导致这一差异的分子机制尚不清晰，阻碍了对酿酒酵母进行理性改造以实现高效转化菊糖生产酒精的工业化进程。本研究首先成功确定了导致酿酒酵母SUC2高效转录调控的关键因素。在菊糖利用型酿酒酵母菌株L610中，SUC2启动子的-390位点突变导致L610的SUC2启动子强度显著提高。突变导致产生一个新的转录因子Msn2/4（压力应激蛋白）结合基序，基因敲除实验结果证实，Msn2/4对SUC2确实具有调控作用，且该调控与葡萄糖浓度有关。其次，研究了翻译后修饰对Suc2酶活性及酿酒酵母细胞代谢菊糖能力的影响。利用定点突变的方法构建了13株Suc2不同位点去N-糖基化修饰的酿酒酵母突变菌株，检测了突变株的相关酶活及乙醇产量，确定了N4、N45、N78和N146位糖链在调节酿酒酵母Suc2活性和菊糖分解代谢中起重要作用。利用定点突变的方法构建了3个不同位点去泛素化修饰的突变体蛋白，并与原始蛋白的酶活力进行比较，结果证实K185位点的泛素化修饰对Suc2的酶活性有显著影响。最后，为提高Suc2的分泌表达水平，分别对酿酒酵母中Suc2的分泌途径和分泌信号肽进行了优化改造。从高尔基体至细胞膜囊泡运输过程中两个关键的酿酒酵母内源蛋白Sec1和Sso2出发，通过基因过表达实验构建了一系列重组菌株，对各重组菌株中Suc2的分泌水平、蔗糖酶酶活力和菊糖酶酶活力进行了分析。结果证实过表达蛋白Sec1和同时过表达Sec1与Sso2能够显著地提高Suc2在酿酒酵母BY4741中的分泌水平。选择了11种不同来源的信号肽分别融合至Suc2并构建了相应的酿酒酵母BY4741重组菌，通过检测重组菌的Suc2表达水平和分泌效率、相关酶活力以及发酵产乙醇能力，最终筛选出来源于毕赤酵母黏性蛋白MSB2的分泌信号肽spMSB2，能够显著提高酿酒酵母中Suc2的分泌表达水平，获得了可以高效利用菊糖发酵产乙醇的重组菌株BY-MS。