水稻氨基酸转运蛋白编码基因OsAAT在抗褐飞虱中的功能研究

The main function of amino acid transporter is regulating amino acid distribution in vivo. In our previous study, research showed that resistance of the recombinant rice plants to brown planthopper was reduced after get rid of an amino acid transporter-encoding gene (OsAAT) in the fine-mapping region of brown planthopper-resistance gene 15 (Bph15), suggesting the OsAAT gene was important for the resistance to brown planthopper. Brown planthopper is rice phloem sap-sucking feeder, the substance characters of rice phloem sap may be changed by the OsAAT protein through regulating amino acid distribution, which affects the feeding of brown planthopper. This may be the difference of plant defense reaction between piercing-sucking insects and chewing insects. Cloning and subcellular localization of the OsAAT gene has been done. Hence, on basis of the previous work, firstly, OsAAT gene expression models will be analyzed; Secondly, transport substrate of the OsAAT gene will be characterized; Thirdly, by using OsAAT gene transgenic rice plants, and in combination with physiological measurement on brown planthopper, rice transcriptome analysis , and gene expression analysis before and after the feeding of brown planthopper, function of the OsAAT gene in the resistance reaction to brown planthopper will be identified here. Results will reveal function of the OsAAT gene, and resistance mechanism of the OsAAT gene to brown planthopper, and will provide the research on rice resistance to brown planthopper and the sustainable development of the agriculture in our country with new ideas.

氨基酸转运蛋白的主要功能是调节体内氨基酸的分布。我们前期研究发现，排除抗褐飞虱基因Bph15精细定位区间内的氨基酸转运蛋白编码基因OsAAT后，重组水稻植株对褐飞虱的抗性明显降低,表明OsAAT基因在抗褐飞虱方面有重要作用。褐飞虱以水稻韧皮部汁液为食,OsAAT可能通过调节氨基酸的分布来改变水稻韧皮部汁液的物质特征，从而影响褐飞虱取食。这可能是植物防御刺吸式昆虫与咀嚼式昆虫取食不同的地方。我们前期完成了OsAAT基因的克隆和亚细胞定位工作。在此基础上，本研究拟首先对OsAAT基因的表达模式进行分析，然后对OsAAT的转运底物进行鉴定，最后利用OsAAT转基因水稻植株，结合取食前后褐飞虱生理指标的测定、水稻转录组分析和基因表达分析，对OsAAT基因在抗褐飞虱中的作用进行研究。研究结果将揭示OsAAT基因的功能及其抗虫性的作用机理，同时也为水稻抗褐飞虱研究和我国绿色农业的可持续发展提供新思路。

由于OsAAT基因来源于药用野生稻，当前数据库中缺乏其ORF完整序列，我们首先利用RACE技术，获得了OsAAT基因的全长cDNA序列。通过生物信息学分析，对OsAAT蛋白的保守结构域和保守功能基序，跨膜结构，以及进化关系进行了研究，结果表明OsAAT是一个比较古老的基因，OsAAT蛋白属于AAAP家族、类氨基酸转运蛋白b亚家族(ATLb)，具有10个跨膜结构域，其N端和C端都位于细胞外侧，而且其氨基酸序列上具有大量物质内吞结构基序Yxxphi。OsAAT-GFP亚细胞定位的结果表明OsAAT基因编码一膜泡氨基酸转运蛋白，这与目前植物中克隆鉴定的氨基酸转运蛋白不同。通过酵母突变体互补实验、膜片钳技术、褐飞虱取食前后OsAAT转基因材料和WT材料的比较转录组分析以及氨基酸含量的变化分析，对OsAAT蛋白的转运底物进行了研究。Southern blot结果表明，OsAAT基因在水稻中都呈单拷贝分布。组织表达模式分析发现，OsAAT基因在水稻营养器官中都有表达，在茎和叶中表达量较高，这也与OsAAT基因启动子融合GUS基因的研究结果一致。通过高盐，高渗透压，生长素IAA以及褐飞虱噬咬处理，发现OsAAT基因特异的受褐飞虱取食诱导；获得了OsAAT转基因材料，对褐飞虱在野生型水稻和转基因水稻中的取食特征进行了研究，表明褐飞虱明显倾向于取食野生型植株；虽然在转基因植株上取食的褐飞虱其蜜露量与取食野生型水稻植株的蜜露量没有显著差异，但取食超表达转基因水稻植株的褐飞虱其虫体生长量明显放缓。表明OsAAT蛋白可能通过调节水稻的营养组成，阻碍了褐飞虱生长。田间表型考察发现，OsAAT超表达转基因植株出现矮化，部分包穗，生长发育缓慢等症状，说明OsAAT可能通过氨基酸的转运，调节了水稻的氮素代谢，进而影响了水稻的生长发育。发表项目资助论文9篇，其中SCI论文三篇。按时完成了申报书的计划任务。