CSE基因调控对杨木木质素分子结构及细胞壁组分拆解和酶解糖化影响机制研究

How to reduce the “biomass recalcitrance” of lignocellulosic biomass is a key and difficult point in the field of lignocellulosic biorefinery. However, the current pretreatment methods have some disadvantages, such as low economical efficiency and structural damage of non-cellulose components. In this project, the lignin synthesis gene CSE (Caffeoyl Shikimate Esterase) was firstly silenced by CRISPR/Cas9 gene editing technology and the over-expressed vector was also established to obtain transgenic 84 K poplar lines with down-regulated and up-regulated CSE expression. The distribution of lignin and the accumulation of cell wall components in the CSE regulated 84 K and control group will be investigated by the technique of confocal Raman microscopy (CRM) and whole plant cell wall NMR characterization techniques. The variations of composition and molecular structures of the native lignin and lignin-carbohydrate complex (LCC) in the CSE transgenic material and control 84K will be interpreted by advanced nuclear magnetic resonance (NMR) techniques. Based on the techniques of in-situ enzymatic hydrolysis and mild disassembly of cell wall components, the relationships among enzymatic hydrolysis efficiency and disassemble performance of cell wall components and “biomass recalcitrance” of lignocellulosic biomass (CSE-regulated 84K) will be revealed. The research of this project will provide theoretical guidance for verification and improvement of lignin biosynthesis pathway of forest woody biomass, cultivating of forest woody plants with low “biomass recalcitrance” and their value-added applications.

如何降低木质纤维生物质抗降解屏障是林木生物质生物炼制领域的重点和难点。然而，当前大部分预处理方法均存在经济性低且非纤维素组分结构破坏等缺陷。本项目率先利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除木质素基因CSE（咖啡酰莽草酸酯酶）及构建过表达载体，获得CSE表达下调和上调的转基因84K杨树。以此为材料，采用共聚焦拉曼显微镜（CRM）及细胞壁全溶核磁表征技术，阐明CSE转基因材料和对照组84K生长过程中的木质素微区分布及组分积累变化规律；采用先进核磁共振分析技术，解译原本木质素和木质素-碳水化合物复合体（LCC）成分及分子结构变化规律；基于纤维素原位酶水解及细胞壁组分温和拆解技术，揭示CSE调控84K杨木酶解糖化效率和细胞壁组分拆解性能与抗降解屏障特性之间的关联性。本项目的研究将为林木生物质木质素生物合成路径的验证和完善、低抗降解屏障林木资源的培育及其高值化利用提供理论指导。

如何降低木质纤维生物质抗降解屏障是林木生物质生物炼制领域的重点和难点。然而，当前大部分预处理方法均存在经济性低且非纤维素组分结构破坏等缺陷。本项目率先利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除木质素基因CSE（咖啡酰莽草酸酯酶）及构建过表达载体，获得CSE表达下调和上调的转基因84K杨树。以此为材料，本项目系统研究了（1）杨木CSE基因突变体及过表达植株的生物学特性；（2）CSE基因调控植株和对照组杨树中木质素的分布和细胞壁组分的积累规律；（3）CSE转基因材料和对照84K中木质素和木质素-碳水化合物复合物(LCC)的组成和分子结构的变化；（4）纤维素结晶度等指标和杨木植株纤维素酶水解之间关系；（5）CSE调控原料结构特性在多种预处理条件下与后续组分拆解及利用性能之间的内在关联性。围绕上述研究内容本项目主要阐明了CSE转基因杨木和对照组84K生长过程中的木质素微区分布及组分积累变化规律，解译了原本木质素和木质素-碳水化合物复合体（LCC）成分及分子结构变化规律，以及CSE调控84K杨木酶解糖化效率和细胞壁组分拆解性能与抗降解屏障特性之间的关联性。总之，研究结果表明，CSE下调杨木植株中含有较低的木质素含量及较低的S/G值，并且CSE下调杨木具有较低的抗降解屏障，有利于后续的组分拆解及利用。同时，我们也采用微波辅助DES预处理技术，完成了对照和其他转基因(C3H、HCT和C3H+HCT共抑制)杨木快速组分拆解，进而提高木质素的提取率和高值化。在本项目的支持下，项目负责人以通讯作者身份共发表SCI论文16篇（已标注基金资助），参编英文专著2部，项目执行期间申请/授权专利7件，其中授权3件中国发明专利，1项澳大利亚革新专利。此外，以第二完成人获得梁希科学技术奖自然科学二等奖1项，连续两年入选2020和2021年度爱思唯尔中国高被引学者，执行期间主要研究人员参加国内学术会议5次并做4次报告。培养了青年骨干研究人员2名，毕业/在读硕博士研究生5名。总体而言，项目已完成研究任务指标，全面实现研究目标。