高灵敏度检测血液中肿瘤标记物miRNAs的新技术研究

There is accumulating evidence that miRNAs expressions are frequently dysregulated in the development of a variety of cancers, and their expression patterns in cancers appear to be tissue-specific. miRNAs profiles are accessible from blood, in a remarkably stable form. Owing to these properties, miRNAs have become an ideal class of blood-based biomarker candidates for clinically validated cancer detection. Recently our group have developed a signal amplification strategy of duplex-specific nuclease signal amplification (DSNSA), and applied it in multiplexed miRNAs detection. In this project, we will further study the basic theory of the DSN's enzymatic mechanism and efficiency, and effectively improve the sensitivity and stability of the DSN method. Moreover, we will extend the DSN-aided signal amplification mechanism to the electrochemical platform. We will also establish a new miRNAs detection method based on miRNAs-mediated isothermal amplification and fluorescent nano-silver clusters as the signal output, which will provide a theoretical basis for the sensitive miRNAs detection in new technology development and clinical diagnostic applications.

研究表明miRNAs表达与肿瘤发生存在着密切关系，血液中miRNAs表达谱的稳定性，高度保守性、时序性和组织特异性使其成为一类理想的肿瘤标记物。最近本课题组发展了一种双链特异性核酸酶（DSN）信号放大技术，并建立了多重miRNA检测方法。在此基础上，本项目将进一步研究DSN酶催化机理及效率等基础理论，有效提高DSN酶介导的miRNAs检测的灵敏度和稳定性，并将DSN酶介导的信号放大机制拓展到电化学平台。同时还将建立一种miRNAs介导的等温扩增和以荧光纳米银簇为信号输出的无标记靶标介导的信号放大新方法,为高灵敏度miRNA检测新技术研究及临床诊断应用提供基础。

研究表明血液(以及其它体液)中miRNAs含量与肿瘤的分期、转移、药物疗效及预后均有密切联系，其高度保守性、稳定性、时序性和组织特异性使其成为一类极具价值的肿瘤标记物。因此，高灵敏特异性定量检测miRNAs对肿瘤早期诊断、预后判断以及药物选择、疗效检测等具有重要意义。本项目针对新型肿瘤标志物miRNAs的高灵敏检测问题开展研究，结合纳米技术、酶高效催化及生物分子工程技术，立足于检测方法中关键步骤信号放大环节，从酶介导的信号放大和纳米材料介导的信号放大两方面系统地开展了高灵敏度miRNAs定量检测新方法的研究，开发了多种新型信号放大机制，建立了相应的高灵敏度miRNAs检测分析新方法，并应用于生物样本中miRNAs的定量检测。这些方法包括基于碱基堆积杂交原理的快速检测miRNAs的实时定量PCR分析方法；基于恒温指数扩增反应的比色和荧光信号的miRNAs检测方法；基于纳米银簇的等温指数扩增反应的多重miRNAs检测方法；基于RNA沉默抑制蛋白-p19蛋白的miRNAs快速检测的荧光偏振法；T7 RNA聚合酶和T4 DNA连接酶偶联的miRNAs实时定量PCR分析方法；多酶偶联级联介导分子信标信号指数扩增的miRNAs检测方法；基于DSN酶介导的miRNAs纳米粒子比色检测法；基于聚多巴胺化学发光能量共振转移和DSN酶介导的靶标循环利用的miRNAs检测方法。在该项目资助下，发表SCI 论文15篇，包括Analytical Chemistry (2篇), Chemical Communications (4篇), Biosensors ＆ Bioelectronics (3篇), ACS Applied Materials & Interfaces (1篇), Analyst (2篇), RSC Advances (3篇)，其中10篇论文影响因子大于5；开发的miRNAs检测新方法申请中国发明专利3项，授权2项；联合培养博士研究生1名，培养硕士研究生7名，其中1名博士研究生获得2015年上海市研究生优秀成果(学位论文)，2名硕士研究生获得2015年上海市研究生优秀成果(学位论文)。