肝癌相关性CD20+B淋巴细胞亚群的筛选、鉴定及其功能机制研究

Liver cancer is a typical tumor associated with immunity and inflammation. The microenvironment of liver cancer is the result of long-term "co evolution" between tumor cells and the immune system. The occurrence and development of liver cancer is not only dependent on the tumor cells’ own characteristics, but also influenced by the interaction of "Organism - tumor immune microenvironment - tumor cells ". For the first time, our previous study indicated that there may exist different subtypes of CD20+B lymphocytes in the liver cancer center, and are involved in the evolution of liver cancer through heterogeneous potential mechanisms. We aim to construct the tumor immune microenvironment research platform by means of high-throughput flow cytometry, multicolor fluorescence staining technology, multi-spectral imaging/ analysis system and transcriptional sequencing analysis team, for the in-depth excavation of the development, distribution, density, phenotype of CD20+B lymphocyte subtypes in HCC center and their roles in the occurrence and development of HCC. In addition, we aim to elucidate the role of CD20+B lymphocyte subsets on the biological characteristics of hepatoma cells and in the interactions of other types of immune cells in vitro, and to evaluate prognostic significance of CD20+B lymphocyte subsets in human HCC tissues. Our study will provide a reliable theoretical guidance and experimental basis to the clinical treatment based on "immune microenvironment".

肝癌是一种典型的免疫和炎症相关性肿瘤，肝癌免疫微环境是癌细胞与免疫系统长期“共进化”的结果。肝癌的发生、发展不仅仅取决于癌细胞自身特质，更受“机体-肿瘤免疫微环境-癌细胞”三者相互作用的影响。申请人前期研究首次发现肝癌中心组织内CD20+B淋巴细胞可能存在不同亚群类型，并通过异质的潜在机制参与肝癌的演进。我们拟利用本组已有的高通量流式细胞分选系统、多色免疫荧光染色技术、多光谱成像分析系统和转录组学测序分析团队，构建肿瘤免疫微环境研究平台，全面观察和深入探讨肝癌中心组织内CD20+B淋巴细胞不同亚群类型的发育、分布、密度、表型及其在肝癌发生、发展中的作用和机制。并在体外细胞水平研究不同亚群类型的CD20+B淋巴细胞对肝癌细胞生物学特性的影响、对其他类型免疫细胞功能的影响，在临床上评估不同亚群类型的CD20+B淋巴细胞的预后价值，为临床基于“免疫微环境”的靶向治疗提供可靠的理论指导和实验依据。

作为一种高度异质性的肿瘤，炎症和肿瘤免疫微环境与肝癌的发生发展息息相关。除外炎症反应，肝癌的发生发展也是一个多因素、多步骤的过程，受到多层次、多水平和多功能的复杂结构体系调控。大量临床研究表明，B细胞在肿瘤中发挥着双向调节作用。其作为体液免疫唯一的主导细胞和免疫反应的核心参与者，在肝癌微环境中的组织分布特性和功能究竟如何，与肝癌微环境中各种免疫/炎性细胞亚群之间的关系、对机体抗癌反应、临床预后和诊疗的影响等关键性问题，以及其亚群、成熟、功能状态、调控机制、分布其临床预后相关性，仍待进一步系统、全面的分析研究。本课题，我们研究了B细胞及其亚群在肝癌肿瘤微环境中异质性分布，以及其在肝癌细胞与微环境对话中的关键地位。通过复合多重免疫荧光方法，评估了两个独立的 HCC队列(n=619)中肿瘤浸润性B细胞及其亚群在肿瘤组织、癌旁组织、外周血中的空间分布和频率，并通过高通量多色流式细胞术进一步验证，明确了肿瘤浸润性B细胞及其亚群与肝癌患者临床病理特征及预后的关系。通过多重免疫组化法确定5个肿瘤相关性B细胞亚群，通过非线性降维模型t-SNE分析，清楚地分离肿瘤浸润性B细胞在肝癌微环境内各亚群上分布的蓝图。肝肿瘤组织中浸润性B细胞及其亚群密度明显降低。而B细胞中浆细胞在肿瘤中的分布频率最为丰富。为后续研究肿瘤细胞与肿瘤浸润性B细胞及其亚群的存在关系及可能的交叉对话提供前期研究。而高密度的肿瘤浸润CD20+B细胞、幼稚B细胞、IgM+记忆B细胞、CD27-同型切换记忆B细胞和浆细胞与肝癌患者较高的生存率相关。多变量分析进一步确定CD20+B细胞、幼稚B细胞和CD27-同型切换记忆B细胞作为独立的生存预测因子，无监督聚类分析证实具有高密度的肿瘤浸润性B细胞亚群肝癌患者具有较高的存活率，提示肝癌进展过程中，B细胞的瘤内浸润及其功能明显受损。通过进一步与其他免疫细胞建立共培养体系，结合单细胞转录组测序，我们进一步发现其B细胞的异质性表型、功能状态，并筛选、 发现、验证不同B细胞亚群分布密度的趋化因子，为靶向肿瘤浸润性B细胞的可行性治疗提供方向和基础性机制理论支持。