小分子AI44靶蛋白过氧化物还原酶1的发现及其抑制NLRP3炎症小体活化的分子机制

Studies have proved that innate immunity and inflammation-reaction mediated by NLRP3 inflammasome play essential roles during the development of inflammation and related disease. Previously we have screened AI44 as an effective candidate for NLRP3 inflammasome inhibition and found that it was benefit for improvement of sepsis in mice. Several evidence suggested its target was Peroxiredoxin1. The project here aims to clarify the character of the AI44-PRDX1 interaction and detailed mechanism for AI44’s NLRP3 inhibition effect from the molecular, cellular and animal levels, demonstrating the role of this mechanism involved in AI44’s anti-inflammation activity：IP, IF, SPR, ITC etal confirm the interaction, chemical structure and pharmacologic activity relationship between AI44 and PRDX1; computer docking, peptide truncation, point mutation for searching the binding site between AI44 and PRDX1; uncovering the effect of AI44 on enzyme activity, oligomerization, phosphorylation, ubiquitin, sub-cellular localization of PRDX1 and the detail mechanism for AI44-driven PRDX1 mediated NLRP3 inhibition; Employ the mice sepsis, colitis disease model for testing the therapeutic effect of AI44. Results of this study will be helpful to provide candidates for the therapy of inflammation and related disease by targeting PRDX1-NLRP3 inflammasome and, more importantly, may help to identify some critical proteins for regulation of NLRP3 inflammasome.

研究表明NLRP3炎症小体介导固有免疫反应对炎症及相关疾病的发生至关重要。前期从系列化合物中发现AI44可高效抑制NLRP3炎症小体活化，对小鼠败血症有较好改善效果，初步证实其靶蛋白为过氧化物还原酶1（PRDX1）。本项目拟从分子、细胞及动物水平研究AI44通过作用于PRDX1抑制NLRP3活化、改善炎症的效果及机制：用免疫共沉淀、免疫荧光、SPR、ITC等多种手段确证AI44与PRDX1结合及其构效关系；用计算机模拟、肽段截短和点突变等确定AI44与PRDX1的结合位点；揭示AI44对PRDX1氧化还原酶活、寡聚化、磷酸化、泛素化及胞内定位的影响并考察AI44通过PRDX1抑制NLRP3炎症小体的分子机制；在败血症和结肠炎模型中探讨AI44的治疗效果。本项目的实施预期为基于NLRP3炎症小体的疾病干预提供药物靶标，为炎症及相关疾病的治疗提供新的思路。

众多研究已表明：NLRP3 炎症小体在免疫应答和炎症反应的发生和调控方面发挥重要作用，其与人类多种重大疾病如自身免疫性疾病、代谢性疾病、神经退行性疾病、肿瘤等的发病密切相关。因此 NLRP3 炎症小体已成为炎症及相关疾病治疗的重要药物作用靶标。.通过建立经典的THP-1炎症小体细胞模型，我们筛选到化合物AI-44，其可剂量依赖性地抑制IL-1β的释放，不影响TNF-α的释放。进一步研究发现AI-44阻碍炎症小体的组装过程中ASC和caspase-1的结合进而抑制caspase-1的自剪切。随后，通过小分子垂钓发现了AI-44作用的靶蛋白-过氧化物酶1（Peroxiredoxin1；PRDX1）。AI-44能够促进caspase-1与PRDX1的结合，使得caspase-1与ASC及NLRP3的结合减少，从而使得NLRP3炎症小体的组装过程受到抑制，进而抑制了NLRP3炎症小体介导的IL-1β的成熟。最后，在LPS诱导的小鼠败血症模型和MSU诱导的小鼠痛风关节炎模型考察了AI-44的治疗效果并验证了相关的机制。实验结果表明AI-44的给药能够明显提高败血症小鼠的生存率。同时AI-44能够有效降低败血症模型小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）和门冬氨酸氨基转移酶（AST）的含量，并且抑制血清和内脏中炎性细胞因子的表达水平。进一步以MSU刺激引起的小鼠急性痛风性关节炎与腹膜炎模型为模型，评价小鼠的足掌、腹腔灌洗液与腹腔召集细胞中的炎症指标，发现AI-44同样具有很好的抗炎活性。同时，无论是在败血症模型还是痛风关节炎模型，体内给药都可显著抑制Caspase-1的活化。.综上所述，本论文通过筛选得到了对NLRP3炎症小体活化介导的IL-1β释放有明显抑制作用的小分子化合物AI-44，阐明了其通过靶向PRDX1促进PRDX1与caspase-1结合而抑制NLRP3炎症小体复合物组装，从而抑制NLRP3炎症小体活化的作用机理，并在小鼠模型证实了其具有显著的治疗效果。我们借助小分子化合物AI-44发现了NLRP3炎症小体新调控方式，为NLRP3炎症小体介导的相关疾病治疗提供了新的药物作用靶标及候选化合物。