穿心莲内酯诱导线粒体自噬调控NLRP3炎症小体活化的分子机制研究

Abnormal activation of NLRP3 inflammasome closely related to the occurrence and development of many inflammatory diseases. It is meaningful by targeting NLRP3 inflammasome for therapy of inflammation-associated disease. Recently we found that a natural compound used in clinical-Andrographolide can significantly alleviated LPS-induced sepsis and DSS-induced colitis while mitophagy-mediated NLRP3 inflammasome inhibition was demonstrated to be involved in this process, but the detailed mechanism is unknown. The project here aims to find out the detailed mechanism for Andrographolide’s mitophagy induction and NLRP3 inhibition effect by examining Bnip3/Nix, PINK1-Parkin, FUNDC1 and Ulk1 signal pathways. And we will try to identify target proteins of Andrographolide, and confirmed its role in the induction of mitophagy and the possibility to be a new drug target. Finally LC3 knockout mice will be employed to confirm the above conclusions. Mechanism of Andrographolide’s anti-inflammation activity will be clarified from the molecular, cellular and animal levels. Results of this study will be helpful to provide candidates for the therapy of inflammation-associated diseases and, more importantly, may help to identify some critical proteins for regulation of NLRP3 inflammasome.

NLRP3炎症小体活化的异常与众多炎症性疾病的发生发展密切相关，针对该靶点的精细调控亦是抗炎免疫领域的热点问题之一。我们前期工作证实穿心莲内酯可显著对抗小鼠败血症及结肠炎，并发现与诱导线粒体自噬和抑制NLRP3炎症小体活化相关，但详细机制不明。本项目拟综合运用分子、细胞生物学方法及靶点垂钓、表面等离子共振、等温滴定量热、分子对接等技术，通过考察Bnip3/Nix、PINK1-Parkin、FUNDC1以及Ulk1信号等明晰穿心莲内酯诱导线粒体自噬的具体环节，在此基础上进一步寻找穿心莲内酯作用的靶蛋白，并确证其在诱导自噬中的作用和作为新药物靶标的可能性，最后运用LC3敲除鼠对穿心莲内酯的作用进行验证，从分子、细胞及动物水平阐明穿心莲内酯诱导线粒体自噬和抑制NLRP3炎症小体活化的详细分子机理。本项目的实施为基于NLRP3炎症小体调控的疾病干预提供药物靶标，为炎症及相关疾病的治疗提供新思路。

NLRP3炎症小体是机体或者细胞应对内源性和外源性危险信号等，介导IL-1、IL-18的成熟释放引发天然免疫反应的大分子复合物。它在抵御病原微生物感染和维持机体自身稳态方面有非常重要的作用，参与众多炎症、免疫系统相关性疾病发生发展。. 本项目主要研究穿心莲内酯抑制NLRP3炎症小体活化的机制和作用靶点。首先，我们考察了穿心莲内酯对多种炎症模型包括败血症、结肠炎、痛风和肺炎的作用，发现穿心莲内酯具有很好的治疗效果。在动物模型中观察到NLRP3炎症小体的活化被显著抑制。我们建立了NLRP3炎症小体活化的细胞模型，LPS+ATP/MSU诱导的炎症小体活化（IL-1β分泌，caspase-1活化，NLRP3/ASC/caspase-1复合物的组装）被穿心莲内酯给药所抑制。通过免疫荧光、免疫印迹以及电镜等手段，我们证实穿心莲内酯可以诱导线粒体自噬的产生。采用自噬抑制剂处理以后，穿心莲内酯的作用效果显著减弱。进一步，我们采用生物素-穿心莲内酯垂钓的方法，银染后结合质谱分析发现了穿心莲内酯的靶蛋白P110，并采用免疫印迹共沉淀，免疫荧光共定位及胞内热迁移蛋白热稳定实验等实验进行了验证，同时采用SPR对结合力进行了测定。通过过表达P110蛋白不同结构域的质粒与生物素-穿心莲内酯的免疫共沉淀发现P110蛋白的577-919与穿心莲内酯发生结合，同时我们结合计算机辅助模拟技术，找到了穿心莲内酯与P110的结合位点，并及采用点突变体结合免疫共沉淀实验进行了验证等手段，确证了P110 G711为穿心莲内酯与P110的结合位点。最后，构建了巨噬细胞敲除P110的条件性敲除鼠，在此基础上我们考察了P110对自噬和NLRP3炎症小体活化的调控作用，发现P110敲低以后，自噬被抑制，炎症小体的活化加剧，同时在敲除小鼠中MSU诱导的痛风发病程度也显著高于野生型小鼠。. 综上所述，本项目的研究阐明了穿心莲内酯通过作用于其靶蛋白P110，诱导线粒体自噬的发生进而抑制NLRP3炎症小体活化的机制，为穿心莲内酯临床应用拓展提供了理论依据，丰富了NLRP3调控的分子网络，并为NLRP3炎症小体相关疾病的临床治疗提供了新的思路。