FAT/CD36介导的日本沼虾脂肪酸代谢分子机理研究

Recently, Macrobrachium nipponense farming has been facing a series of problems such as retarded growth, small body and early ovarian maturation. Our previous study has proven that dietary lipid (fatty acids) nutrition can regulate the growth and development, and also the mRNA expression of two genes related to intracellular fatty acids metabolism of M. nipponense. In this project, we attempt to explore the molecular regulatory mechanism of fatty acid translocase (FAT/CD36), an important long chain fatty acid transporter, in fatty acids metabolism of M. nipponense in vivo and in vitro, of which the following main content will be investigated: (1) to clone FAT/CD36 cDNA full length from M. nipponense and examine mRNA tissue-dependent expression patterns; (2) to investigate FAT/CD36 mRNA expression in M. nipponense hepatopancreas cells treated with different fatty acids and examine the relationship between FAT/CD36 and metabolism regulators related to fatty acids; (3) to evaluate the effects of dietary different fatty acids on the expression of FAT/CD36 and lipid metabolism in vivo; (4) to observe the lipid metabolism factors after injection of FAT/CD36 double stranded RNA (dsRNA) into abdominal body cavity of M. nipponense which have been fed different fatty acids diets for 60 days. This study will richen the research date of crustacean lipid metabolism and regulation mechanism, and further guide the production of formula feed of economic shrimps.

针对日本沼虾养殖业中出现的生长缓慢、规格偏小、提前抱卵等一系列问题，在前期证实饲料中脂肪（酸）对其生长发育及胞内脂肪酸代谢基因表达起重要调节作用的基础上，拟进一步从脂肪酸跨膜转运的重要载体蛋白—脂肪酸转位酶（FAT/CD36）入手，从体内外的角度深入探索FAT/CD36基因在日本沼虾脂肪酸代谢中分子作用机理。克隆日本沼虾FAT/CD36 cDNA全长，分析基因组织表达特性；培养日本沼虾肝胰腺细胞，分析脂肪酸种类对FAT/CD36表达的调节作用，观测其与脂肪酸代谢相关因子动态关系；使用不同脂肪酸配制精制饲料进行日本沼虾室内养殖试验，比较分析脂肪酸对FAT/CD36表达水平及相关代谢因子的影响；选取养殖结束后部分虾体注射dsRNA （双链RNA），沉默FAT/CD36，分析脂质代谢因子及组织脂肪酸组成比例的变化。研究结果将丰富甲壳动物脂类代谢及调控机理的研究资料，并指导经济虾类配合饲料生产。

日本沼虾为我国重要的淡水经济养殖种类之一,近年来在实际生产中出现了个体生长缓慢、规格偏小等一系列问题，制约着该虾养殖业进一步发展。本研究拟从脂肪酸跨膜转运的重要载体蛋白—脂肪酸转位酶（FAT/CD36）入手，从体内外的角度深入探索FAT/CD36基因在日本沼虾脂肪酸代谢中分子作用机理。结果如下：（1）通过转录组测序（GSE78788），发现一含CD36结构域基因，起初命名为FAT/CD36，后经比对及进化树发现其与日本对虾的SR-BI基因更为接近，同时文库种未发现其它具CD36结构域的基因，因此将其命名为MnSR-BI。SR-BI是B类Ⅰ型清道夫受体，属于CD36清道夫受体家族中的一种跨膜蛋白，在脂质稳态调节方面起着很重要的作用，因此猜测MnSR-BI可能具有了包括FAT/CD36基因功能的多种功能。MnSR-BI基因完整编码区长为1545 bp，其蛋白含一个CD36结构域，N-端和C-端分别含有一个跨膜区。MnSR-BI氨基酸序列与其它物种CD36清道夫受体家族成员相似性约34-41%。MnSR-BI在肝胰腺组织中高表达。（2）饲料脂肪源如亚麻籽油和豆油促进肝胰腺MnSR-BI基因表达，dsRNA干扰抑制了肝胰腺中MnSR-BI基因的表达，同时引起了脂质代谢相关基因（CPT1, ACC, FABP10和ACBP）的表达变化。但亚麻籽油和豆油对虾体的生长促进作用不显著。（3）饲料中0.86%花生四烯酸（ARA）促进了日本沼虾的生长，0.28%ARA显著上调MnSR-BI基因的表达，0.28-0.54%ARA显著提高脂肪酸转运相关基因（FATP4和FABP10）的mRNA表达。（4）1.66-2.02%饲料亚麻酸（LNA）显著提高MnSR-BI基因的表达，同时乙酰辅酶A羧化酶、△9去饱和酶和脂肪酸延长酶6表达量也随饲料中LNA含量的升高呈降低趋势。（5）在体外，使用不同浓度ARA孵化日本沼虾原代肝胰腺细胞，过高的ARA浓度（1 000 μmol/L）会降低细胞的活力，适宜的ARA浓度（50-100 μmol/L）可促进脂肪酸脱饱和酶、碳链延长酶及脂肪酸转运相关基因（MnSR-BI, FABP10和ACBP）的mRNA表达。本研究首次分析日本沼虾具有CD36结构域的SR-BI基因，并分析体内外脂肪酸脂肪酸营养对其表达的影响，结果可为甲壳动物SR-BI基因的研究提供参考。