日本沼虾Mnfoxl2基因在早期性别分化及雌雄生长差异中的作用

The oriental river prawn (Macrobrachium nipponense) shows significantly growth difference between male and female. The males grow faster and gain more weight at harvest time than females, thus the all male population breeding would be dramatically economic. The researches on sex-determination and sex-differentiation mechanisms would provide basic information for sex-control and all-population breeding. Recently studies showed that the sex-determination and sex growth difference of crustacean species was regulated by the gene expression on growth axis. Our previous studies confirmed that Forkhead box protein L2 (Mnfoxl2) was dramatically expressed in testes, suggesting that Mnfoxl2 is a new male development related genes in M. nipponense. Thus, in order to analysis of the relationship between Mnfoxl2 and M. nipponense growth, RNA interference (RNAi) is used to block the Mnfoxl2 expression in full sibs of M. nipponense larvae, further combined with the studies of male and female differentiation ratio, the volume of sex hormone and the regulatory relationship with the genes on growth axis and reproductive axis, analyzing the Mnfoxl2 function in sex-differentiation and sex growth difference. This project will carry out the function of Mnfoxl2 in sex-differentiation mechanism and the relationship with sex growth difference, providing basic information for sex-control and all-male breeding techniques.

同龄日本沼虾存在雌雄个体生长差异，雄虾生长速度及收获期规格显著高于雌虾，全雄虾养殖的经济效益显著。认识日本沼虾的性别决定和性别分化机制是其性别调控和全雄制种技术的基础。研究证实，虾类性别决定及其雌雄生长差异与其生长轴基因表达相关。本课题组前期研究获得日本沼虾雄性发育相关新基因--叉头框蛋白L2（Mnfoxl2），且发现该基因在精巢中高表达。在此基础上，本项申请拟以日本沼虾全同胞家系幼体为研究材料，利用RNA干扰（RNAi）技术，在日本沼虾性别分化早期，阻碍Mnfoxl2的表达，并结合雌雄分化比例、性激素分泌检测和与生长轴生殖轴基因调控分析，研究Mnfoxl2基因与日本沼虾生长的调控关系，分析该基因对幼龄日本沼虾性别分化以及雌雄生长差异的影响。通过该项研究，以期揭示Mnfoxl2基因在日本沼虾性别分化过程中作用及其与雌雄生长差异的关系，为建立日本沼虾性别控制技术和形成全雄虾制种技术奠定基础。

日本沼虾（Macrobrachium nipponense）俗称青虾或河虾，是我国重要的淡水经济虾类，在我国分布广泛。日本沼虾的雌雄个体生长差异显著，其同龄雄性个体的生长速度明显快于雌性，收获期时，雄虾个体的大小约为雌虾的2-2.5倍。因此，建立全雄制种技术，实现青虾全雄化养殖具有广泛的应用前景以及巨大的经济价值。促雄腺是甲壳类动物特有的内分泌腺，其分泌的激素对甲壳类动物雄性发育及雄性特征维持方面具有重要的作用。本研究以青虾为研究对象，通过组织学切片以及类固醇激素测定等方法对变态后发育时期的幼虾进行组织研究，结果表明青虾性别分化关键时期为变态后第10天至变态后第22天，且青虾促雄腺发育对精巢发育的具有调控作用，为日后青虾性别相关基因的筛选提供理论依据。通过高通量测序技术构建青虾性别分化关键时期转录组及miRNA文库，共筛选得到9个共差异表达miRNA，荧光定量PCR验证结果显示，共有3个在促雄腺中具有高表达的共差异miRNA，基因促雄腺在甲壳类动物雄性分化及发育过程中的重要作用，这3个在促雄腺中高表达的共差异miRNA和其调控的11个差异表达基因极可能参与青虾性别分化机制。通过iTRAQ技术对青虾繁殖季节促雄腺以及非繁殖季节促雄腺进行蛋白质差异表达分子，共筛选得到10个具有功能注释的差异表达蛋白，通过荧光定量PCR对其在精巢、卵巢以及促雄腺中进行验证，共筛选得到3个在促雄腺中高表达的差异蛋白，可能参与青虾雄性发育。通过RACE克隆、原位杂交以及RNAi等方法初步验证了Foxl2基因在青虾性别分化以及雌雄生长差异中的作用，并初步确认GEM、Rev3、Ferritin peptide以及Sox基因为青虾性别相关基因，分析了其在青虾雄性发育过程中的作用。项目的实施丰富了青虾性别决定机制的研究，为建立青虾全雄制种技术，培育青虾全雄养殖群体提供理论依据。