海马先天性无脾与Tlx1基因突变的相关性研究

The spleen is one of the most important immune organs in vertebrates. Seahorse (genus Hippcompus) is congenital absence of the spleen, which is a special event in the evolutionary history of vertebrate organ. Tlx1 gene has been reported to be a key regular in the development of the spleen in vertebrates, and the gene functional domain is much conserved. Based on the results of bioinformatic analysis and biological experiments, the applicants found that the functional domain of Tlx1 gene in three kinds of seahorse occurred a common mutation (p. Ala200Thr), resulting in the change of the structure of the hydrophobic contact area, which affected the function of the gene. Consequently, the applicants proposed the hypothesis that the mutation of Tlx1 gene resulted in seahorse congenital asplenia. This project intends to explore the structural features of Tlx1 gene and protein by bioinformatics analysis and homologous modeling, to study the impact of the mutation on its function. Through in situ hybridization and immunohistochemistry, we will study the spatiotemporal expression pattern and the target of the Tlx1 gene in the embryo, to analyze the potential function of the gene in the development of embryo of seahorse. We will use CRISPR/Cas9 knockout technology to verify the function of Tlx1 gene in spleen occurrence of seahorse, and further use site-directed mutagenesis (g. 622A>G) to clarify the correlation of seahorse congenital asplenia and Tlx1 gene mutation. This application could reveal the reason of seahorse congenital asplenia and make up the blank of the research on the development of fish spleen, and consequently has important implications to study of the evolution of vertebrate spleen and its gene regulation mechanism.

脾脏是脊椎动物最重要的免疫器官之一，而海马先天性缺失脾脏，是脊椎动物器官进化史上的特殊事件。Tlx1基因在脊椎动物脾脏发生中起核心调控作用，其功能域高度保守，而三种海马的Tlx1基因发生了共有的突变，导致功能域三维结构变化，影响了原有功能。据此，申请人提出Tlx1基因功能域突变导致海马先天性无脾的假设。本项目拟通过分析Tlx1基因序列特征和蛋白三维结构，研究该突变对其结构和功能的潜在影响；通过原位杂交和免疫组化分析Tlx1基因在海马胚胎期的时空表达模式和作用靶点，研究Tlx1基因在海马胚胎发育中的潜在功能；利用CRISPR/Cas9技术，在模式生物斑马鱼中敲除并定点突变（g. 622A>G）Tlx1基因，研究Tlx1基因在海马胚胎发生中的作用，揭示海马先天性无脾与Tlx1基因突变的相关性。本申请不仅能揭示海马先天性无脾的原因，同时对研究脊椎动物脾脏发生的进化及其基因调控机制具有重要意义。

脾脏是脊椎动物最重要的免疫器官之一，而海马先天性缺失脾脏，是脊椎动物器官进化史上的特殊事件，因此，研究海马先天性脾脏缺失的关键原因具有重要意义。申请人在前期通过对海马基因组的解析，发现脊椎动物脾脏发生的关键基因Tlx1在海马中出现了特异性突变。据此，申请人进一步对Tlx1基因的结构和功能进行了深入研究，主要包括多种海马属鱼类的Tlx1基因结构克隆和比对，Tlx1基因在海马胚胎发育的表达，在模式生物斑马鱼中敲除并定点突变Tlx1基因。结果发现多种海马的Tlx1基因发生共有的突变（g. 598G>A），并引起对应的氨基酸突变（p. Ala200Thr），由脂肪族氨基酸突变为羟基类氨基酸，疏水接触区形成受阻，影响了Tlx1对下游基因的调控；海马的Tlx1 基因受到强烈的正选择；自受精卵开始发育至器官完全形成的过程中，Tlx1的表达量一直较高而稳定，预示着Tlx1基因在海马中功能缺失或变化。此外，利用CRISPR/Cas9技术在斑马鱼中敲除，获得了Ihb184和ihb185基因型突变品系，但F2 代斑马鱼 Tlx1 基因的敲除纯合体（Tlx1-/-）没有表现出特殊的死亡率和畸形率。同时对斑马鱼Tlx1 基因的点突变实验，获得了F0代斑马鱼中tlx1点突变（G619A）系，但F2 代斑马鱼 Tlx1 基因的敲除纯合体（Tlx1-/-）没有表现出特殊的死亡率和畸形率。此外，发现海马中存在疑似胰腺的器官，该器官具有典型的外膜包被，是一个独立的器官；内部具有大量分泌型细胞和导管，可能具有分泌功能。该器官内胰岛素、胰高血糖素、蛋白酶合成及代谢相关基因显著富集。基于以上解剖学、组织学、转录组学数据推断，海马具有独立的胰脏器官，进行胰岛素合成与蛋白酶合成与分泌。.综上所述，通过多层次的结构和功能研究，确定了多种海马属鱼类的Tlx1基因存在共同的特殊突变，基本确立了 Tlx1基因的突变是引起海马缺失脾脏的原因，说明Tlx1基因在海马中出现了功能异化；海马先天性缺失脾脏，但是出现了补偿策略——身体中有一种特殊的疑似胰腺的器官，执行着正常鱼类脾脏的一些生理功能。本研究成果为深入了解脊椎动物脾脏发生的进化及其基因调控机制的研究具有重要的借鉴意义。